hiv-1+tat核心碱性区随机突变组合文库的构建及亲和筛选

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1、HIV-1Tat核心碱性区随机突变组合文库的构建及亲和筛选中文摘要中又摘要人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)归属于逆转录病毒科中慢病毒属，主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，AIDS)，即艾滋病。目前，艾滋病感染已经成为全球所面临的重大公共卫生问题。研制有效的HIV疫苗是艾滋病防治的重要手段之一。因此，探索HIV疫苗研究的新策略和寻找新的疫苗靶点对疫苗的成功研发显得尤为重要。HIV-1反式激活蛋白(Tralls．activatoroftranscr

2、iption，Tat)是HIV感染早期产生的一种重要调控蛋白，在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。HIVol感染靶细胞后，胞质中合成的Tat转移到核内，与多种转录调控因子结合组成转录起始复合体(transcriptioninitiationcomplex，TIC)，促进病毒RNA的转录、延伸和病毒复制【lJ。此外，Tat还可被感染细胞通过多种方式分泌到胞外发挥“病毒毒素”的作用：①通过诱导CD4+T细胞、NK细胞或B细胞的凋亡，发挥其免疫抑制的作用【2，3，4，5，6】：②通过JAK／STAT信号转导途经激活HHV．8的复制，或通过RGD(Arg—Gly．Asp)与内皮细胞0Lvp

3、3和a5p，整合素结合，与可溶性炎症因子和血管生成因子协同促进卡波氏肉瘤(Kaposi’Ssarcoma,KS)的形成p芦J；③通过影响神经细胞钙流，诱导巨噬细胞和小胶质细胞表达TGF．p、TNF等神经毒性物质，发挥神经毒作用，促进艾滋病脑病的发生[9,10,1I]。Tat碱性氨基酸富集区(49—57aa)是Tat的穿膜和核定位功能基序，是Tat蛋白的主要中和表位之一。其中和抗体可消除Tat分子所特有的穿入其他细胞发挥毒性的核心功能【l21。此外，Tat碱性区序列在各亚型间高度保守，有利于产生交叉反应谱更广的抗体。已有研究表明，构建Tat5l位、55位定点突变后，碱性区表位未被破坏，且Ta

4、t穿膜活性和胞外活性被大大减弱Il3。。因此本研究拟利用噬菌体展示技术分子进化平台，对天然Tat碱性区进行重组改造和筛选，为保证Tat碱性区表位的完整性，我们保留了Tat核心区(38．48aa)，构建由核心碱性区突变片段经随机连接肽相互连接的重复串联的噬菌体展示文库，用含有高中和活性Tat抗体的兔抗血清进行亲和筛选，以期获得一系列碱性区表位构象稳定，而生物活性明显降低的突变体序列，为新型Tat疫苗的研发做基础研究。第二军医大学硕士学位论文本研究分以下三部分进行：一、HIV-IPET32a．Tat3s-6l蛋白的表达及免疫反应性鉴定功能研究表明：Tat蛋白核心区(38-48aa)可与旁观未感

5、染细胞的微管蛋白结合引发细胞凋亡f141；Tat蛋白碱性区(49．57aa)介导Tat蛋白穿膜，与Tat细胞外活性密切相关‘14,15】。结构研究表明【16】：Tat分子为天然非折叠蛋白，属于无规则卷曲类型的分子，缺乏稳定的二级结构和高级结构，其分子构想极不稳定，出于快速动态的变化之中，导致以Tat作为抗原，刺激效果差，高亲和力的抗体较少且容易被降解。因此，Tat核心碱性区重要表位是否能够得到保留是噬菌体突变文库亲和筛选的基础。为此，我们首先将Tat的核心碱性区38．61aa构建到原核表达载体，纯化出PET32a-Tat38．6l蛋白，并通过含有Tat抗体的阳性血清对其进行免疫反应性鉴定。

6、根据大肠杆菌偏好密码子优化后的IIIV-1型HXB2株TatDNA序列设计引物，用PCR方法合成HIV-1tat38-6l序列，T／A克隆法将其克隆到pMDl8．T载体进行测序。将测序正确的tat38．6l克隆至原核表达载体pET32a，构建其原核表达质粒pET32a-tat38-61。将表达质粒转入E．coliBL21(DE3)中，IPTG诱导表达出相对分子量为21300的融合蛋白，并用Ni-NTA亲和层析法纯化PET32a-Tat38-6l蛋白。分别用本实验室制备的兔抗PEPTIDE．Tatl．10l血清和上海市公共卫生中心提供的HIV阳性血清进行ELISA检测，鉴定PET32a-Ta

7、t38．6I蛋白的免疫反应性。结果显示：(DPET32a．Tat38-61与兔抗PEPTIDE．TatI．10l血清【171呈特异性反应，且反应强度低于阳性对照蛋白PET32a．Tatl．10l，载体蛋白PET32a有微弱反应。②在12例HIV阳性血清中，有4例与PET32a-Tat38_6l有明确的特异性反应，有6例与阳性对照全长蛋白PET32a-Tatl．10l呈特异性反应，并且包含了全部4例与PET32a-Tat3