基于双向位点特异性pcr的金银花真伪鉴别方法研究

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1、基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法研究1.湖南省宜章县中医医院424200;2.湖南省宜章县中医医院424200;3.湖南芷江侗族自治县中医医院419100【摘要】目的探析基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴別方法。方法选取来自口个产地的88份植物样木为研究对象,包扌舌金银花真品、金银花伪品及两者混杂品,将其随机分为两组,每组44份。对照组采用实验鉴别,观察组采用双向位点特异性PCR技术辨别,对比分析鉴别效果。结果当退火温度为61°C时,真品金银花条带为468hp,伪品条带为324hp,正品金银花中掺杂5%以上伪品可同时出现正品与伪品条带,两组在鉴别结果有明

2、显差异(P>0.05);观察组的鉴别时间短于对照组(PV0.05)。结论双向位点特异性PCR检测技术可有效辨别金银花的真品、伪品及混杂品,在未破坏金银花样木组织结构及材质的情况下,可有效辨别金银花真伪,具有较强的优良性,更值得进一步推广和应用。【关键词】双向位点特异性PCR;金银花;真伪鉴别金银花又名忍冬,药科金银花属忍冬科忍冬属植物及同属植物干燥花蕾或带初开的花,外貌上形似于华南忍冬,具有清热解毒之功效。伪品金银花[12]主要包括苦糖果、金银木,且无正品金银花的药效,如被误当真品服用,将会延误治疗。因此,采用正确的方法对其真伪进行辨别尤为重要。木文选取来自口个产地的8

3、8份植物样木为研究对象,对双向位点特异性PCR鉴别金银花真伪的重要价值进行评价,具体如下。1材料与方法1.1材料选取来自山东平邑、河南封丘、河北巨鹿、广西马山、湖南隆回及湖北、江西、广东、重庆、陕西、江西□个产地的88份植物样木为研究对象,所选样本主要包括忍冬32个,华南忍冬6个,灰毡毛忍冬8个,黃褐毛忍冬8个,水忍冬12个,金银忍冬6个,繁果忍冬7个,红腺忍冬9个。所有药材均经相关部门批准,符合药材选择标准⑴。同吋,选取购自市场上经炮制的药材进行双向位点特异性PCR鉴别。1.2仪器与试剂1.2.1仪醫生选用东胜龙二代ETC811新款PCR仪为检测仪器,温度为0-105

4、°C,热盖温度30-110°C,显示精度为0.1°C,温度准确度性为±0.1°C@55°C,温度均一性为<0.3°C@55°C,温度梯度为5°C/s,梯度跨度为1-42°C,输入电压为AC220V(±10%)50/60Hz。选用Eppendorf小型台式冷冻高速离心机5427R,温度范围为-ll°C~40°C,离心计时为10s-10h,最大功率为550W,最大容量为48×1.5/2.0mlo选用Biorad伯乐凝胶成像系统,检测器为CCD,像素为4.65×4.65μm,像素密度为4096,工作湿度为<70%,工作

5、温度为10-28°Co1.2.1试齐I」SunShineBio琼脂糖(原产于西班牙,供应商:南京生兴生物技术有限公司);Sigma-Aldric化乙卩定(原产于美国,供应商:北京基尼亚生物技术有限公司);Promega聚合酶(保定市凌业商贸有限公司)。1.3方法观察组:取干燥材料100mg,并提取入选材料的DNA,不同样品的DNA浓度约为10mg/L,利用引物(trnF.trnL,各0.2pmol)对PCR反应及DNA质量进行检测。在PCR扩增仪上进行反应,待反应结束后在反应体系中增加适量缓冲剂,待混合均匀后在EB染色的1%琼脂酸凝胶点上检测,并使用凝胶成像系统进行系统

6、化的观察。对照组:取该品粉末0.2g,加入5ml甲醇,并将其放置12小时后过滤溶液,使用照高效液相色谱法对金银花含量进行检测。1.4统计学方法本研究所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行数据统计,计量资料用(+s)进行表示,计数资料用%表示,P<0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1SNP位点的筛选与引物根据数据库中显示的忍冬属植物的叶绿体序列,并使用软件对比不同序列间的内在联系,对忍冬属植物的trnF-trnL序列进行分析,结果显示trnF-trnL序列的625位均为G,而其他物种均为A。以SNP为主要位点,双向位点特异性PCR引物的序列情况如表1所示

7、。2.2双向位点特异性PCR反应条件在建立单侧位点特异性PCR的基础上设计另一侧的引物,并优化反应循环数目及内侧与外侧的引物浓度,确定Bi-PASA的反应条件。实验研究结果表明,对APRMS分型产生影响的相关因素较多,其中包括退火温度、Tap酶种类、用量等,且金银花的使用量相对较低。但由于Bi-PASA所使用巢式引物极易造成正常的PCR扩增过程受限,因此,将Bi-PASA内外侧的比例优化为3:1,此吋,金银花Bi-PASA的结果最佳。2.3金银花真伪当退火温度为61°C时,真品金银花条带为468hp,伪品条带为324hp,正品金银花中掺杂

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