atg4b蛋白调节早期断奶仔猪线粒体自噬的研究

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1、华中农业大学硕士学位论文Atg4B蛋白调节早期断奶仔猪线粒体自噬的研究姓名：李潇申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：晏向华201206At94B蛋白调节早期断奶仔猪线粒体自噬的研究摘要在畜牧生产中，为了提高养猪经济效益，仔猪的断奶时间不断提前。但早期断奶应激会对仔猪生理、营养等方面造成严重的影响。自噬作为一种广泛存在于真核生物中的机制，在多种生命进程中都发挥着重要作用。有研究表明，自噬的激活对于维持动物从出生后至吸吮到足够母乳之前这一阶段的生命活动是不可或缺的，但对早期断奶应激是否会诱导自噬的发生以及自噬在这一过程中的作用还有

2、待进一步研究阐明。本试验内容主要包括三部分：1．研究早期断奶应激是否会诱导仔猪体内自噬的发生；2．At94B蛋白在自噬体的形成过程中具有重要作用，若早期断奶应激会诱导自噬的发生，那么At94B的表达量是否对自噬的活性具有影响；3．用不含血清及亮氨酸、精氨酸和赖氨酸的低糖DMEM培养基处理HEK293T细胞来模拟仔猪早期断奶应激引起的营养缺乏状况，细胞经饥饿处理2h诱导自噬发生后，以At94B为诱饵蛋白，通过串联亲和纯化技术和质谱分析，筛选在自噬发生过程中与At94B存在相互作用关系的新的候选蛋白。研究结果如下：。1．通过对仔猪血液生理生化指标

3、的检测发现，仔猪血液各项生理指标均无显著性差异(尸>O．05)，但试验组仔猪(断奶24h)与15日龄对照组仔猪相比，血液中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、淋巴细胞百分比(LY％)和单核细胞百分比(MO％)都有下降的趋势，中性粒细胞百分比(GR％)稍有升高；此外，试验组(断奶24h)仔猪血清中葡萄糖浓度、胰岛素和白细胞介素．6水平分别降低了31．60％、36．14％、32．11％(尸<0．05)，胰高血糖素含量下降了62．15％(氏0．01)，皮质醇水平升高了67．72％(尸<0．05)。表明14日龄断奶对仔猪造成了

4、营养缺乏、机体能量代谢水平下降、免疫力降低等应激。2．通过WesternBlot和透射电镜检测证明，14日龄断奶后，仔猪肝脏、脾脏和骨骼肌中自噬水平显著升高(P<0．01)，且在断奶后的24h内，自噬水平成上升趋势。3．通过免疫组化技术检测仔猪肝脏和骨骼肌中At94B蛋白表达量的情况发现，正常哺乳情况下，14日龄和15日龄仔猪肝脏和骨骼肌中At94B的表达量没有明显变化(尸>O．05)，但断奶24h后，两种组织内At94B的表达水平都极显著降低(P<0．01)。4．运用串联亲和纯化技术和质谱分析后发现，在饥饿诱导的自噬过程中，At94B蛋白可

5、能与LRPPRC、CANDl、IMMT、SLC27A4、ATP5A1等候选蛋白存在相互作用关系，暗示着At94B与线粒体在饥饿应激诱导的自噬过程中存在着某种联系。华中农业大学2012届硕士学位论文5．通过对线粒体细胞色素c氧化酶亚基COXⅣ以及线粒体膜电位的检测发现，在饥饿情况下，线粒体氧化呼吸功能受损，线粒体膜电位下降，而线粒体内膜非特异性通透性孔道抑制剂环保菌素A能抑制饥饿应激引起的线粒体去极化，同时也抑制了细胞内自噬溶酶体的扩增，表明此时细胞内发生了能特异性清除受损线粒体的线粒体自噬。综合所有的试验结果，可以得出以下结论：仔猪早期断奶应

6、激会诱导自噬的发生，在这过程中At醇B蛋白的表达水平会降低；在饥饿应激过程中，细胞除了利用自噬机制来维持细胞内稳态、促进细胞存活以外，还启动了线粒体自噬来特异性地清除受损的线粒体；LRPPRC等候选蛋白可能通过与At94B蛋白的相互作用参与了自噬或线粒体自噬的调节过程。关键词：仔猪；早期断奶应激；自噬；At94B；线粒体自噬At94B蛋白调节早期断奶仔猪线粒体自噬的研究AbstractInanimalproduction，inordertoimprovetheeconomicbenefit，theweaningtimeofpigletsisc

7、ontinuouslyshortening．Butearlyweaningwillforcethepigletssubjecttomyrialstressorsfromphysiologicalandnutrition．Autophagyubiquitouslyexistsinalleukaryoticcells，whichplaysanimportantroleinmanyprocessoflife．Recentstudieshaveshownthattheactivationofautophagyisnecessaryforthemain

8、tenanceofanimalssurviveatthestageoffrombirthtosuckenoughmilk．However,thephysiologi