dna甲基化在神经病理性疼痛发病机制中的作用

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1、博士学位论文密级DNA甲基化在神经病理性疼痛发病机制中的作用TheroleofDNAmethylationinthepathogenesisofneuropathicDaln⋯●作者姓名：学科专业：学院(系、所)：指导教师：王英麻醉学湘雅医院郭曲练教授答辩委员会主中南大学二o～二年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明

2、确的说明。作者签名：之筵日期：丝[z年上月韭日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：日期：醴年土月五日博士学位论文中文摘要摘要研究背景神经病理性疼痛由神经系统的损害或炎症引起，是一种常见而特殊的慢性疼痛，以痛觉过敏、异常痛敏和自发痛为特征。目前发病机制不清

3、，发病率逐年上升，处理非常棘手而且目前的治疗方法疗效不佳，是医学领域的挑战性研究课题。众多研究表明外周和中枢敏化在神经病理性疼痛的产生和维持中发挥重要作用。外周和中枢敏化均与初级感觉神经元、次级感觉神经元以及胶质细胞上疼痛相关分子和受体基因的转录和表达水平的改变密切相关。表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变，主要体现在DNA碱基上发生的甲基化修饰、染色质重塑、基因印记、X．染色体失活以及非编码RNA调控等方面。其中DNA甲基化是最早发现又普遍存在的基因表观修饰方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA高甲基化能关闭相关基因的活性，去甲基化则可以诱导

4、基因的重新活化和表达。于是推测，表观遗传学机制尤其是DNA甲基化机制很可能参与神经病理性疼痛的发生发展。相关研究较少，本课题的开展和顺利完成可为神经病理性疼痛的机制和治疗研究提供新的思路和方向。研究目的观察总体DNA甲基化水平在坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic博士学位论文中文摘要constrictioninjury，CCI)大鼠脊髓腰膨大中的变化；观察DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)DNMT1、DNMT3a和DNMT3b及甲基化CpG连接蛋白2(methyl—CpG-bindingprotein2，MeCP2)在CCI大鼠脊髓

5、腰膨大中表达的变化：观察神经病理性疼痛重要相关因子谷氨酸脱羧酶67(glutamatedecarboxylase67，GAD67)在CCI大鼠脊髓腰膨大中表达的变化及其编码基因GADl启动子甲基化水平在CCI大鼠脊髓腰膨大中的变化；采用DNMT特异性抑制剂5．氮杂胞苷(5：azacytidine，5-AZA)鞘内注射，观察其对CCI大鼠神经病理性疼痛的调节作用，探索神经病理性疼痛的DNA甲基化调控机制。研究方法1．雄。[生Sprague。Dawley(SD)成年大鼠随机分为假手术组(sham组)和CCI组，测量各组大鼠机械痛阈和热痛阂基础值后，参考Bennett和Xie等的

6、方法构建大鼠左侧CCI模型；sham组进行同样的手术，暴露坐骨神经但不结扎。分别于术后第3、5、7、i0、14天再次测定各组大鼠的机械痛阈和热痛阈。各组大鼠术后14天测试完毕后于深麻醉下处死，取脊髓腰膨大段测定其总体DNA甲基化水平。2．Sham组和CCI组大鼠术后14天测试完毕后于深麻醉下处死，取脊髓腰膨大段采用免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)和蛋白印迹(westernblot)方法检测其DNMTl、DNMT3a、DNMT3b及MeCP2的表达。3．Sham组和CCI组

7、大鼠术后14天测试完毕后于深麻醉下处死，II博士学位论文中文摘要取脊髓腰膨大段采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real．timequantitativeRT-PCR，qRT-PCR)方法检测其GAD67mRNA的表达，采用焦磷酸测序方法检测其编码基因GAD1启动子区域的甲基化水平。4．腰段鞘内置管成功的雄性SD成年大鼠随机分为3组：假手术+生理盐水组(sham+NS组)、CCI+生理盐水组(CCI+NS组)、CCI+5·AZA10州组(CCI+5．AZA组)。术后第3天开始鞘内注射NS或5-AZA10州(溶于N