sv40t转基因小鼠胃粘膜癌变机理的研究

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1、郑州大学硕士学位论文SV40T转基因小鼠胃粘膜癌变机理的研究姓名：赵君亮申请学位级别：硕士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：张钦宪201205郑州大学2012届硕士学位论文摘要SV40T转基因小鼠胃粘膜癌变机理的研究研究生：赵君亮导师：张钦宪教授郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室河南郑州450001摘要猴空泡病毒40(SV40)，是一种DNA病毒，SV40Tag是SV40中调节细胞周期的重要蛋白，在体外可使人以及动物的多种组织的正常细胞发生恶性进展，常应用于转基因动物模型的制作，在转基因动物体内可诱发多种肿瘤形成。体外的细胞培养结果都说明SV4

2、0T抗原有助于致癌基因的转化。T抗原作用于抑癌基因Rb和wp53，使Rb、wp53分别与SV40T上的I曲结合域、p53结合域结合，从而使Rb、、卵53丧失抑癌蛋白的作用，而解除了它们对细胞周期的控制，使细胞加速分裂、无限生长，进而导致肿瘤的形成。在大多数情况下，T抗原通过诱导I№蛋白的失活(pRB，p130，p107)进入细胞周期，从而激活E2F依赖的转录和随后进入S期。同时，T抗原阻止x—p53的活性，从而可防止随之而来的细胞周期停滞和细胞凋亡。在前期研究中，本课题组利用显微注射法制备了胃壁细胞特异性表达SV40T抗原的转基因小鼠，得到了28、4

3、4、84、16。、244、514、5矿、61岸、689和734等十个品系的Go代转基因阳性小鼠，经过九代的传代培养，SV40T基因已经在小鼠体内可以稳定遗传和表达。并发现转基因阳性小鼠胃粘膜均有增生。为了研究胃粘膜从增生至癌变的发生机理，我们利用己建立的胃壁细胞特异性表达SV40Tag的转基因小鼠模型，用RT．PCR和Westernblotting等实验技术对244品系转基因小鼠(胃粘膜增生)和73。品系转基因小鼠(胃粘膜癌变)中Rb基因及其通路主要成员E2F．1。CyclinD1和CDK4的表达水平进行了研究，探讨SV40Tag和Rb在胃粘膜癌变过

4、程中的作用及机制。方法：1．用HE染色对6只244品系雄性转基因小鼠、6只734品系雄性转基因小鼠和6只正常雄性小鼠的脾、肺、肝脏、小肠、大肠、睾丸、胃等组织染色观郑州大学2012届硕士学位论文摘要察小鼠各个器官的病理学变化。2．用RT-PCR对6只244品系雄性转基因小鼠、6只734品系雄性转基因小鼠和6只正常雄性小鼠检测Rb基因及其通路相关基因(E2F．1、CyclinD1和CDK4)在胃粘膜和睾丸中rnRNA水平表达。3．应用Westernblotting技术对6只244品系雄性转基因小鼠、6只734品系雄性转基因小鼠和6只正常雄性小鼠检测I№

5、基因及其通路相关基因(E2F．1、CyclinD1和CDK4)在胃粘膜和睾丸中蛋白水平表达的差异。4．用免疫组织化学染色方法对6只734品系雄性转基因小鼠的睾丸进行抗SV40Tag的抗体检测。结果：1．HE染色的结果显示，在248品系雄性转基因小鼠的病理切片中可以看Nd,鼠的胃粘膜发生了明显的增生，成熟壁细胞的数量减少，734品系雄性转基因小鼠胃粘膜出现了早期癌变的症状，而且其睾丸的病理切片显示了其发生了癌变。2．RT-PCR的结果显示，在SV40Tag存在的情况下，Rb基因在mRNA水平的表达与正常组织相比，显著降低，P<0．05；而I拍通路相关基

6、因E2F．1、CyclinD1及CDK4等mRNA水平的表达显著提高，P<0．05。3．Westernblotting的结果显示，在SV40Tag存在的情况下，Rb基因在蛋白水平的表达与正常组织相比，显著降低，P<0．05；而Rb通路相关基因E2F．1、蛋白水平的表达显著提高，尸<0．05；CyclinD1及CDK4蛋白水平的表达没有检测出来。4．免疫组织化学的结果显示，在734品系转基因小鼠的睾丸部位检测到了SV40Tag的表达。结论：1．SV40Tag转基因小鼠通过SV40Tag下调I№基因的RNA和蛋白的表达，而上调Rb通路相关基因E2F．1、

7、CyclinD1和CDK4的tLNA和E2F．1蛋白的表达，提示SV40Tag可能通过抑制I№抑癌基因的信号途径而参与此转基因小鼠的癌变模式。2．734品系转基因小鼠睾丸的癌变与SV40Tag的表达有关。关键词：CyclinD1；Rb；SV40T；小鼠；转基因动物Ⅱ郑州大学2012届硕士学位论文AbstractStudyonthecancerationmechanismofgastricmucosaintheSV40TtransgenicmiceM．D．Candidate：JunliangZhaoSupervisor：Prof．QinxianZhan

8、gDepartmentofHistology&EmbryologyCollegeofBasicMedicin