丛枝菌根真菌对丹参根部病害的抗病性及其机理研究

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1、西南交通大学硕士学位论文丛枝菌根真菌对丹参根部病害的抗病性及其机理研究姓名：杨立申请学位级别：硕士专业：中药学指导教师：邵爱娟；陈美兰20120426西南交通大学硕士研究生学位论文第f页摘要丹参(SalviamiltiorrhizaBge)，俗称活血根，是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物，年需求量15000吨左右，是栽培面积较大的药材之一。但是，随着丹参栽培年限延长，根部病害的发生率逐年提高，栽培2～4年丹参根部病害的发生率达到了60％．70％，严重影响丹参的产量和质量，而丹参根部病害的化学防治效果甚微。目前采用生物防

2、治方法是解决中药材根部病害的最佳选择。丛枝菌根真菌(ArbuscularMycorrhizalFungi，AMF)在抗植物土传病害方面具有很大的潜力，但是AMF对于不同的病原菌，其抗病性不同。国内外关于AM-F对植物病害的抗病机理也没有统一定论。本论文主要针对丹参栽培过程中的上述问题，采用AMF作为生防菌，研究AMF对丹参根部病害的抗病规律及其机理。其旨在有效缓解栽培丹参根部病害的发生，为提高丹参的产量和质量提供指导，同时为中药材根部病害的研究提供一种新的思路和方法。实验方法1、丹参根部病害病原菌的分离、纯化与鉴定。(1

3、)采集丹参病株，取病健交界部位采用PDA培养基分离纯化病原菌，记录菌落形态特征，在光学显微镜下观察培养病原菌的分生孢子和分生孢子梗形态，并测量其大小。根据病原菌的菌落形态及产孢结构，对其进行传统形态学鉴定。(2)采用CTAB法提取病原菌DNA，选取真菌通用引用ITS扩增目的核酸片段，测序，在NCBI的GENBANK库中进行序列比对，判断所获菌株的种类或其近缘的物种。2、在温室盆栽条件下，采用蘸根接种病原菌的方法，研究病原菌对丹参幼苗的致病性及生理生化方面的影响。(1)采用计数法计算植物发病率，并统计接菌后7d对地上和地下

4、部分鲜重的影响。(2)分别检测病原菌处理后ld、3d、5d、7d、lld对丹参幼苗根内多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)四种与植物诱导抗病性相关的防御酶活性的变化情况。(3)选择SA途径和JA途径上的病程相关蛋白和防御基因序列，设计引物，采用RT．qPCR的方法子病原菌蘸根处理后3d、5d、7d，对丹参幼苗根中的病程相关基因表达变化进行分析。(4)采用SPSSl6．0统计软件对实验结果进行统计分析。3、在温室盆栽条件下，研究不同种类丛枝菌根真菌(Arbuscul

5、arMycorrhizaiFungi，西南交通大学硕士研究生学位论文第1l页AMF)[摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)、地表球囊霉(Glomusversiforing，GV)、根内球囊霉(Glomusintraradices，GI)]对丹参生长及有效成分的影响。(1)根据Bierman和Linderman(1981)建立的方法测定不同AMF处理后365天的菌根侵染率以评估不同AMF与丹参的共生情况。(2)考察不同AMF处理后365天对丹参株高，地上地下部分分枝数，地上地下部分干重等生物量积累的影响。(3)采

6、用国际上通用的Li．6400便携式光合作用系统考察不同AMF处理后丹参幼苗叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(丹)、气孔导度(Gs)和胞间C02浓度(a)等气体交换参数的动态变化，并同时测定了叶片中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和可溶性糖含量，从光合作用的角度阐释AMF影响丹参生物量积累的机理。(4)采用ICP．AES法检测接种AMF对丹参地上部分、地下部分大量元素钾K，微量元素铜Cu、锌Zn、镁Mg、铁Fe、锰Mn、钙Ca含量的变化情况。(5)采用HPLC法检测接种AMF对丹参植株水溶性成分迷迭香酸和丹酚酸B以及脂溶性成

7、分丹参酮I、丹参酮IIA、二氢丹参酮、丹参新酮积累的影响。(6)采用SPSSl6．0统计软件对实验结果进行统计分析。4、在温室盆栽条件下，采用蘸根接种病原菌的方法，研究AMF对丹参根部病害的防治效果及其抗病机理。(1-)采用计数法计算植物发病率，根据病害分级标准，计算病情指数，并统计接菌后20d对地上和地下部分鲜重，株高、根长的影响。(2)采用WinRHIZO根系分析系统观测接菌后20d不同处理组根长(Length)，根面积(SurfArea)，根投影面积(ProjArea)，根体积(Volume)和根尖数(Tips)，

8、以及根的发病部位(Disease)与健康部位(Healthy)的颜色对比分析，阐释AMF对丹参根部病害的防治效果。(3)采用MIN．PAM调制式荧光分析仪测定接菌后14d不同处理组丹参植物叶片最大光化学量子PSII产量Fv／Fm、最大光化学量子PSII效率Yield、光化学碎灭系数qP、非光化学碎灭系数qN等叶绿素荧