草鱼呼肠孤病毒感染对草鱼细胞rnai信号通路激活方式的影响

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1、学校代码：10264研究生学号：M090104219上海海洋大学硕士学位论文草鱼呼肠孤病毒感染对草鱼细胞RNAi题目：信号通路激活方式的影响EffectofGrasscarpreovirusinfectionon英文题目：triggeringtheRNAisignalpathwayingrasscarpcells专业：临床兽医学研究方向：病毒分子生物学姓名：郭帅指导教师：吕利群教授二〇一二年四月六日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得

2、的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后

3、适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注王永杰上海海洋大学教授主席严继舟上海海洋大学教授委员徐鸿绪中山大学医学院副教授委员许丹上海海洋大学讲师秘书答辩地点国家水生动物病原库101室答辩日期2012.05.19上海海洋大学硕士学位论文摘要草鱼是我国淡水养殖的主要品种之一，约占我国总养殖量的23%。引起草鱼出血病的草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus，GCRV)流行广、危害大、发病季节长

4、，致死率高，是我国淡水养殖中最为突出的问题之一。目前对该病毒还没有有效防治的药物或方法，因而进行抗草鱼呼肠孤病毒的研究具有重要意义。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一种由小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)介导的基因沉默途径，它广泛存在于各种生物中，具有高度特异性和高效性，可以用来作为抑制病毒表达的工具。本文主要的研究是草鱼肾细胞(Ctenopharyngodonidelluskidneycells，CIK)中GCRV的感染对RNAi信号通路激活方式的影响，主要分以下几个方面：1

5、、验证CIK中是否存在RNAi。将质粒pEGFP-N1和体外人工合成的egfp(荧光蛋白基因)特异的双链RNA(EGFP-dsRNA)共转染到CIK细胞中。48h后，用荧光显微镜观察EGFP蛋白的荧光强度，实时定量PCR(qRT-PCR)检测egfpmRNA的表达量，以及用以DIG标记的egfpRNA探针进行NorthernBlot检测是否有egfp特异的小分子RNA生成。结果显示，共转染质粒pEGFP-N1与EGFP-dsRNA的EGFP蛋白的荧光强度很弱，egfpmRNA的表达量也很低，而且产生了egfp特异的小分子RNA，但是

6、共转染S10(GCRV第10条基因组片段)特异的dsRNA(S10-dsRNA)和pEGFP-N1的荧光强度很强，egfpmRNA的表达量也很高，而且没有产生egfp特异的小分子RNA。这些结果说明CIK细胞中存在着RNAi。2、GCRV感染对CIK细胞中RNAi信号通路激活方式的影响，共分三个方面。①研究了GCRV裸链dsRNA基因组与RNAi的相互作用。将GCRV的裸链基因组dsRNA和人工合成的S10-dsRNA，分别转染入CIK细胞，用DIG标记的S10RNA作为探针，进行NorthernBlot用来检测S10特异的小分子R

7、NA的生成水平。结果显示，未被GCRV感染的CIK细胞，分别转染GCRV的裸链dsRNA和S10-dsRNA都产生了S10序列特异的小分子RNA，但是GCRV感染组没有特异的小分子RNA的产生，初步推断GCRV裸链基因组对Dicer蛋白敏感，而GCRV的感染能够保护基因组dsRNA不被RNAi降解成病毒特异的小分子RNA；②研究GCRV的感染对siRNA介导的基因沉默的影响。将人工合成的egfp特异的siRNA(EGFP-siRNA)与pEGFP-N1共转染到GCRV感染过的CIK细胞中，转染48h后荧光显微镜下观察EGFP蛋白的荧

8、光强度，以及用qRT-PCR检测细胞总I上海海洋大学硕士学位论文mRNA中egfpmRNA的表达情况。结果显示，GCRV感染的CIK细胞中共转染pEGFP-N1和EGFP-siRNA的实验组有很强的荧光信号与只转染pEGFP-N1的信