免疫层析法检测山羊传染性胸膜肺炎抗体试纸条的研制

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1、宁夏大学硕士学位论文免疫层析法检测山羊传染性胸膜肺炎抗体试纸条的研制姓名：高珊申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：许立华；逯忠新；储岳峰201204摘要山羊传染性胸膜肺炎(CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)引起的山羊的一种高度接触性传染病，是世界动物卫生组织(OIE)法定报告传染病之一。近几年，我国相继在甘肃、山东等地分离或检NNccPP的病原倒kMccp，表明该病在我国流行。准确诊断是是防治该病的前提条件之～。目前，国外已报道多种CCPP血清学诊断方法，如补体结合试验、竞争ELI

2、SA试验等，但多有诸如操作复杂、重复性或特异性差、需实验室仪器等缺点，尤其不适合于我国动物疾病诊断实际中快速、易于操作和适于基层使用的要求。免疫胶体金技术具有方便快捷、稳定性强、特异、敏感、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观、可以保存等优点，在医学和兽医免疫诊断领域应用广泛。因此，本研究运用胶体金免疫层析技术，建立一种快速、简便、灵敏的检澳gMccP抗体的方法。本实验用Mccp全菌为抗原，常规免疫健康家兔，间接血凝试验检测抗体效价达1：1024以上后收集兔血清，然后采用硫酸铵盐析和ProteinG抗体纯

3、化柱获得兔抗Mccp多克隆抗体，应用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS—PAGE)法检测其纯度；采用MEM—KM2培养基扩大Mccp的培养，经10000r／min离心菌体，从上清液中提取Mccp荚膜多糖备用。采用柠檬酸三钠还原法制备25nm的胶体金颗粒，胶体金标记纯化后的Mccp，最佳标记量和最适pH值的测定结果分别为50Hg／ml和7．0，低温超速离心法纯化标记好的金标抗原；用纯化的Mccp分泌多糖抗原包被试纸条的检测线，最适划线浓度为2．0mg／ml，Mccp多克隆抗体用于质控线的包被，最适

4、划线浓度为1．6mg／ml。检测试纸条对已知阳性和阴性血清进行实验，检测时间约10min，阳性血清在检测线和质控线出现两条明显的红色条带，检验结果为阳性，而PBS在质控线上出现红色条带，在检测线未出现，检验结果呈阴性，与预期设计的结果相符合。对试纸条进行了敏感性、重复性、特异性实验。结果显示：血清效价为1：1024的Mccp阳性血清稀释80倍，仍可以检测出来；不同批次试纸条重复检测，结果无明显差异；试纸条不与绵羊肺炎支原体，丝状支原体山羊亚种等血清有交叉反应。本研究所建立的检测抗体的胶体金免疫层析试纸条

5、具有较高的敏感性、重复性和特异性，为Mccp的快速诊断奠定了基础。关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种，荚膜多糖，胶体金技术，多克隆抗体AbstractContagiouscaprinepleuropneumonia(CCPP)，causedbyMycoplasmacapricolumsubsp．capripneumoniae(Mccp)，isadevastingdiseaseincludedinthelistofnotifiablediseasesoftheWorldOrganizationforAnima

6、lHeMth(OIE)becauseofitssignificanteconomicimpactongoatindustryworldwide．Inrecentyears，severalstrainsofMccphasbeenisolatedordetectedfromgoatsamplesinGansu，GhandongProvinces，etc．ItindicatesthatCCPPisendemicincurrentChina．Accuratediagnosisisoneoftheprecondi

7、tionofthepreventionandcontrolofthedisease．Atpresent，avarietyofCCPPserologicaldiagnosticmethodshasbeenreportedoverseas．However,therearemanydisadvantagesofthesemethods，suchascomplicatedoperation,poorreproducibilityorspecificity,speciallaboratoryequipmentan

8、dSOon．Itisnotsuitablefortherequirementsofpracticewiththefeaturesofrapiddetection，easyoperationandsuitabilityforbaseleveleddiagnosticdepartmentsofanimaldiseasesinChina．Therearemanyadvantagesofimmunecolloidalgoldtechnique，su