腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染

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1、腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞详情见AD-293Cells.pdf，AdEasy™AdenoviralVectorSystem.pdf（P31-P32）2.细胞转染方法一、详情见Adeno-XExpressionSystem1UserManual.pdf（P28-P29）C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf3.病毒收集详情见AdEasy™AdenoviralVectorSystem.pdf（P34）二、扩增详情见Adeno-XExpressionSystem1UserManual.pdf（P29-P30）三、纯化(i)病毒上清（接一、包装3.病毒收集）.(i

2、i)Add51mlofa50%PEG6000solution.(iii)Add21.7mlofa4MNaClstocksolution.(iv)Add23.3mlofPBS.Thiswillresultinafinalvolumeof300ml.ThefinalPEG6000concentrationwillbe8.5%andthefinalNaClconcentrationwillbeB0.3M.(v)Distributethesampleas150-mlaliquotsintwo250-mlpolypropylenewide-mouthedbottles.(vi)Storethebot

3、tlesat41Cfor1.5h.Mixcontentsevery20–30min.(vii)Centrifugebottlesat7,000gfor10minat41CusingaBeckmanfixed-angelJLA-10.500rotor.(viii)Aftercentrifugation,awhitepelletshouldbevisible.(ix)Carefullydecantthesupernatantandadd1.2mlof50mMTris-HCl,pH7.4,perbottle.Resuspendthepelletsbyvigorouslypipettingliqu

4、idupanddown.(x)Vortexthebottlesvigorouslyfor20–30stofurtherresuspendthepellets.(xi)Transferthevectorsuspensionintoscrew-capmicrofugetubesinaliquotsof100ml.(xii)Snap-freezethetubesincrusheddryiceandstoreat-80。C.a.按照10ml的病毒上清加入2.5ml的50%PEG6000混合；b.加入1.064ml的4M的NaCl混匀；c.加入1.142ml的PBS混匀；d.4°C下，孵育1.5h，

5、每20-30min颠倒混匀；e.4°C下，7000g离心10min。f.小心移除上清，切勿触动白色沉淀，如果白色沉淀出现松动，可以在7000g下短暂离心；g.加入原病毒上清1/200to1/100体积的PBS重悬沉淀病毒粒子；h.立即对浓缩纯化的病毒粒子进行滴度测定，并分装后（50-100ul/管）冻存于-80°C超低温冰箱中；上述所需试剂配制方法见Production,concentrationandtitrationofpseudotypedHIV-1-basedlentiviralvectors.pdf（P3）一、滴度测定病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc病毒滴度测定

6、-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc二、感染详情见Adeno-XExpressionSystem1UserManual.pdf（P31）a.感染前24小时，把细胞传代至35mm平皿中，加入完全培养基至终体积3ml，培养过夜，感染时，细胞密度为80–90%；b.把冻存于-80°C的病毒取出并在室温下冻融；c.用新的完全培养基更换培养液，并加入冻融的病毒粒子（MOI为50-100）和polybrene（4μg/ml），培养液终体积为3ml；d.感染8-24h后，用新3-4ml新完全培养基更换感染培养液；e.感染48小时后收取细胞进行QPCR检测，感染72小时后收取细胞进行WB检测；