质谱及相关技术在信号传导方面地研究进展

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1、第31卷分析化学(FENXIHUAXUE)　评述与进展第2期2003年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry232～238评述与进展质谱及相关技术在信号传导方面的研究进展1,231邓　斌　罗国安12(清华大学生命科学与工程研究院,北京100084)(云南烟草研究院,昆明650106)摘　要　细胞信号传导是近年来生命科学研究的热点之一。有关蛋白转录后修饰(如蛋白质磷酸化、乙酰化、糖基化等),信号肽序列测定,信号传导途径和多通道调节方式,蛋白自折叠及构象变化,小分子脂类信号分子等研究由于质谱

2、技术的快速发展而取得了突破性的进展。关键词　信号传导,质谱,双向凝胶电泳,高效液相色谱,数据库,评述1　引　　言细胞信号传导(signaltransduction)是20世纪90年代以来生命科学研究领域的一大热点。最近几年“美国科学信息研究所”,(ISI)对热点科学研究论文统计的数据表明,有关信号传导方面的研究均名列前茅,而科技界的权威期刊《Science》和《Nature》更是不定期地出版这方面的专刊。信号传导的基本概念是指细胞外因子通过与受体(膜受体或核受体)结合,引发细胞内的一系列生物化学反应,蛋白与蛋白的相互作用,

3、直至细胞生理反应所需基因开始表达的过程。主要内容包括细胞外因子、受体、第二信使信号系统、蛋白2蛋白的相互作用、G蛋白、胞浆激酶、核受体等。随着以软电离离子化质谱技术的飞速发展,质谱技术在信号传导的研究中发挥了越来越重要的作用。以电喷雾(ESI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱及其与飞行时间质谱(TOF)结合的Q2TOF和MALDI2TOF技术,在不同方面加强了对信号传导中传导途径、信号蛋白的结构、磷酸化修饰及位点确定1等的研究进展。在ESI2MS中,分辨率可达4000(mPz,质荷比)。一般来说,分子量低于100k

4、D的多电荷蛋白分子分子量都可被测定。而由酶消化的蛋白质或核酸混合物可在串联的四极杆检测仪中被分离分析并提供部分肽段和核酸的一级结构和修饰后的结构信息。MALDI和TOF的结合能使检测量程达到610(mPz),监测样品灵敏度可达fmol级。傅里叶转换离子回旋共振(FTICR)质谱则是通过使用高磁场-182捕获离子,分辨率可达到100000(mPz),10～50amol(10mol)的蛋白质和肽可被检测到。Q2TOF则将四极杆的高离子选择性和TOF对离子碎片的高分离效率结合了起来,充分发挥了TOF在低分子量范围的高扫描速度和高

5、分辨率的优点。ESI2MSPMS与HPLC相结合可对分子量较大的蛋白质酶解肽谱进行定性定量分析。微柱HPLC(内径0.075～0.5mm)则可使检测灵敏度到100fmol以上。近年来,能监测到10～100nmolPL纳喷雾源3(nano2electrospraysource)和微喷雾源(micro2ionspraysource)技术得到了进一步发展并已广泛应用于蛋白质的鉴定和肽段的测序中;毛细管电泳与TOF或离子阱质量分析器的结合极大地提高了复杂体系的4检测灵敏度,将大大加强对信号传导工作的研究进程。2　在转录后修饰方面的

6、研究进展由于蛋白质在表达过程中存在转录后修饰作用(如磷酸化、乙酰化等),所以仅简单分析病变和信号传导过程中mRNA的变化是不够的。磷酸化分析对信号传导过程的研究有着重要的意义。质谱可以对蛋白质或肽的分子量进行选择性观测。因此,比较适合于对转录后蛋白质修饰的鉴定。以往对磷酸化2001212220收稿;2002205201接受本文系国家973计划项目(批准号G1999054404)第2期邓　斌等:质谱及相关技术在信号传导方面的研究进展233修饰位点的研究是用快原子轰击离子化等质量检测器来进行的。一般都需要提供HPLC纯化的蛋白

7、质样品。在均一样品中,一般通过对修饰前后的蛋白质酶解肽质量标准谱进行比较,然后通过PSD和CID5肽测序去推断磷酸化位点。而在复杂混合物的酶解产物(特别在特定信号传导过程中引起的蛋白质或酶激活)中,要对如此微量的蛋白修饰位点进行确定是比较困难的。往往需要引入气相化学反应来辅助进行。另外,细胞内的蛋白分子经常通过放射性同位素标记前体,然后对其在代谢过程中的变化进行观察,通过平板凝胶电泳(SDS2PAGE)方法来分离并染色。将需要的条带剪下后进行质谱分析可确定其磷酸化修饰作用情况。通过这种方法确定了以下蛋白质的磷酸化修饰作用情

8、况:凝血酶引起的血小板67变化;晶体组织中的异戊二烯化作用;老鼠的药理实验中对乙酰氨基酚与肝蛋白的共价加成物变8化。随着MALDI2TOF,LCPMSPMS等技术的发展,可直接对复杂样品中蛋白质磷酸化过程进行研究。表1列出了近年来部分应用质谱技术方法来确定信号传导过程中蛋白质磷酸化修饰作用和其它相关生物