黄喉拟水龟ccl20基因序列特征及表达分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M090101056上海海洋大学硕士学位论文黄喉拟水龟CCL20基因序列特征及表达题目：分析StudyOnGeneSequence英文题目：CharacteristicsAndExpressionOfCCL20InMauremysMutica专业：水产养殖研究方向：种质资源与遗传育种姓名：龙建杰指导老师朱新平研究员二O一二年六月三日1上海海洋大学硕士学位论文中国水产科学院珠江水产研究所黄喉拟水龟CCL20基因序列特征及表达分析龙建杰指导老师：朱新平（研究员）申请学位：硕士

2、研究方向：水产动物遗传育种论文递交日期：2012年3月论文答辩日期：2012年5月学位授予单位和日期：上海海洋大学2012年6月论文评阅人：答辩委员会主席：答辩委员会委员：2012年5月8日1ShanghaiOceanUniversityMasterDissertationPearlRiverFisheryResearchInstituteStudyOnGeneSequenceCharacteristicsAndExpressionOfCCL20InMauremysMuticabyLongJianjie

3、Advisor:Prof.ZhuXinpingMainfield:FisheryHeredityBreedingJune,20121上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版

4、权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日1上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注李桂峰中山大学教授主席罗建仁珠江水产研究所研究员委员卢

5、迈新珠江水产研究所研究员委员陈昆慈珠江水产研究所研究员委员赵建珠江水产研究所助理研究员秘书中国水产科学研究答辩地点：答辩日期：2012.5.25院珠江水产研究所2黄喉拟水龟CCL20基因序列特征及表达分析摘要利用本实验室构建的黄喉拟水龟SMART全长cDNA文库，筛选得到巨噬细胞炎症蛋白-3α（MaMIP-3α或MaCCL20）全长cDNA序列，Maccl20基因cDNA全长2318bp，5’非编码区（Untranslatedregion,UTR）长1525bp，3’UTR长532bp，开放阅读框（Op

6、enreadingframe,ORF）为261bp，编码86个氨基酸组成的多肽链，分子量为9.739kDa，理论等电点为9.004。综合亲水性表面可及性以及抗原指数三项指标，预测可形成抗原表位的氨基酸区域数为7。同源性分析表明，黄喉拟水龟与变色蜥（Anoliscarolinensis）、原鸡（Gallusgallus）的巨噬细胞炎症蛋白-3α亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示：MaMIP-3α在肝脏、肾脏、心脏、脾脏中均有表达，脾脏中表达量最高。根据黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α（Mauremysm

7、uticaCantorMacrophageinflammatoryprotein3α，MaMIP-3α或MaCCL20）的cDNA全长设计特异性引物，然后采用PCR克隆技术从黄喉拟水龟的肝脏组织中克隆出MaMIP-3α的成熟肽的基因序列。将得到的成熟肽序列插入到PMD18-T克隆载体上，转化进大肠杆菌E.coliDH5α中，得到的质粒经PCR以及测序鉴定正确后，将双酶切目的片段插入到表达载体pET-32a上，构建成原核表达重组质粒pET-32a-CCL20并将表达质粒转化入大肠杆菌BL21中，经IPTG

8、诱导后成功表达出了pET-32a-CCL20融合蛋白。以该融合蛋白为抗原制备了多克隆抗体。经过测序分析表明，MaCCL20的成熟太基因序列成功的插入到表达载体Pet-32a中。经过IPTG诱导表达、SDS-PAGE凝胶电泳和Westernbolt分析显示，所表达的融合蛋白的相对分子质量约为30KD，与目的蛋白大小一致并且与带His标签的单克隆抗体发生特异性反应。经HisBind镍柱纯化后SDS-PAGE凝胶电泳检测出现单一条带。实验结果表明