采用代谢组学策略探究佛手散对急性血瘀大鼠活血化瘀作用机制

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1、采用代谢组学策略探究佛手散对急性血瘀大鼠活血化瘀作用机制［摘要］采用冰水浴游泳和皮下注射盐酸肾上腺素法复制急性血瘀大鼠模型。采用UPLC-Q-TOF/MS方法分析正常大鼠、急性血瘀大鼠和给药佛手散干预急性血瘀大鼠尿液之间的内源性代谢物差异，并通过变量重要性投影选取潜在的生物标志物，结合质谱信息和数据库检索对潜在的生物标志物进行鉴定，将鉴定到的生物标志物输入MetPA数据库中构建代谢通路。研究急性血瘀大鼠给药佛手散后大鼠尿液内源性代谢物变化，寻找可能的生物标志物，探讨佛手散的活血化瘀作用机制。结果在急性血瘀大鼠尿液中发现并鉴定了11个潜在的生物标志物，这些标志物主要和苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢和

2、鞘脂类代谢3条代谢通路相关。而佛手散可调节急性血瘀模型大鼠体内紊乱的代谢通路并使其向正常状态转归。该研究结果表明代谢组学在中药整体性药效评价、作用机制的阐明等方面具有很好的应用前景。［关键词］UPLC-Q-TOF/MS；佛手散；代谢组；急性血瘀;活血化瘀佛手散出自宋•许叔微《普济本事方》，为养血活血之剂，由当归6两、川苇4两组成，每服2钱，水一小盏，煎至将干，投酒一大盏，止一沸，去渣温服，主治妊娠伤胎、难产、胞衣不下等。该方在临床主要用于妇女调经及心脑血管疾病等。本课题组前期研究发现，佛手散对急性血瘀大鼠的血液流变学和凝血功能相关指标有显著的改善作用［1］O但其作用机制尚不明确，而代谢组学作

3、为后基因组时代的一种全新的组学技术，它从整体观出发，通过考察由病理生理刺激或遗传修饰引起的生物体内源性低分子量代谢产物的动态规律变化或其随时间的变化，来研究整体的生物学状况［2］。代谢组学最显著的特点在于抛开体内纷繁复杂的生理过程，选择机体终端代谢产物“自上而下”进行分析，与中药研究的整体观思维较为一致［3］。本研究以佛手散和盐酸肾上腺素加冰浴游泳诱导的急性血瘀大鼠模型为研究对象，采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术，分析急性血瘀大鼠模型的代谢表型变化及给予佛手散后对急性血瘀大鼠的作用机制，探讨代谢组学在动物模型复制和中药药效研究中的应用。1材料1.1

4、仪器与试剂美国WatersUPLCAcquityTM系统；BEHC18色谱柱（2.1mmX50mm,1.7um）；SynaptTMQ-TOF质谱仪，配有Lock-spray接口，ESI离子源和MassLynx4.1质谱工作站软件。盐酸肾上腺素注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号1003121）；叠氮钠（NaN3,分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；肝素钠注射液（常州千红生化制药股份有限公司，批号100731）；乙睛和甲酸为色谱纯试剂（美国Fisher公司）；亮氨酸-脑啡肽（美国Sigma公司）；纯净水由南京易普易达纯水仪制得。其他试剂均为分析纯。1.2动物SPF级SD大鼠，雌性，体重（200±2

5、0）g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（沪）2008-0016o1.3药材及样品制备当归为伞形科植物当归Angelicasinensis（Oliv.）Diels的干燥根，来源于甘肃岷县当归GAP种植基地；川苇为伞形科植物川＜LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，来源于四川彭州川苇GAP种植基地，并经南京中医药大学严辉副教授鉴定。按佛手散中当归与川苇的比例（3：2）称取药材饮片，混合，共500go用8倍量的水进行热回流提取两次，每次均为2h,自然冷却后，倾出水溶液，过滤。药渣再用95%乙醇进行热回流提取2h,自然冷却后，倾出乙醇水溶液，过滤药渣

6、，与水提液合并，进行真空减压浓缩，干燥至浸膏，得制备样品。2方法2.1急性血瘀模型的复制大鼠皮下注射盐酸肾上腺素注射液0.8mg・kgl共2次，间隔时间为4h。第1次皮下给予盐酸肾上腺素后2h,将大鼠置于0〜2°C冰水中游泳4min,造成大鼠急性血瘀模型［4］。2.2动物分组及给药实验动物按体重随机分为3组，每组9只，分别为正常组（control）,模型组（model）和佛手散组（FSS）o佛手散给药剂量为临床等效量的6倍量（5.4g生药/kg大鼠体重）。实验开始前各组动物自由饲养一周，然后置代谢笼中自由饲养适应3do佛手散组大鼠每日早晚各灌胃1次，共7次，正常组和模型组大鼠灌胃给予等量的生

7、理盐水。在造模过程中，正常组大鼠亦皮下注射等量生理盐水。模型组和佛手散大鼠于实验的第3天按照2.1项下方法造模。2.3尿液样品收集与处理实验第3天模型组和佛手散组大鼠最后一次注射盐酸肾上腺素后，连同正常组大鼠禁食不禁水，收集尿液12h,接尿管中加1mLl%NaN3作为抑菌剂和防腐剂。收集的尿液于4°C离心机3000r-mini离心10min,取上清2mL置冷冻管中，浸入液氮罐中进行快速淬灭，然后捞出冷冻（-2