胎盘羊膜和绒毛膜间充质干细胞生物学特性及羊膜间充质干细胞移植修复大鼠局灶性脑缺血的实验研究

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：套劣日苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信

2、息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在——年一月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：导师签名：日熊弓已日期：趁l圣：圣：堕期：Z魈：3：绍胎盘羊膜和绒毛膜问充质干细胞生物学矧蜘蛸骥间充质干细胞侈植修复大鼠局灶性脑缺血的实验研究中文摘要中又捅斐间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是一种具有自我更新和多向分化能力的干细胞，有着潜在的临床应用

3、价值。以往研究主要集中在人骨髓来源的间充质干细胞，但由于人骨髓来源的间充质干细胞的获得需要通过骨髓穿刺，而且其数量随年龄的增长而急剧下降，限制了人骨髓源间充质干细胞的应用。近年来有实验表明，MSCs还可从脐血、胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周血及肌肉等组织中分离得到。其中，胎盘组织最受关注，它除了在胎儿发育、营养支持和维持耐受中发挥重要作用外，含有丰富的成体干细胞，成为寻找人类成体干／祖细胞的新组织来源。胎盘来源MSCs的表型、分化潜能与骨髓MSCs相似，且胎盘作为孕妇分娩后的废弃物，易于获得且对其研究和应用无伦理道德的争论，目前已成为问充质干细胞来源的新的研究热点。胎盘羊膜中胚层(

4、AmnioticMesoderm)和绒毛膜中胚层(ChorionicMesoderm)分别是体外分离获得羊膜间充质干细胞(AmnioticMesenchymalstemcells，AMSCs)和绒毛膜间充质干细胞(ChorionicMesenchymalstemcells，CMSCs)的组织来源，两者均由胚胎发育过程中的胚外中胚层(ExtroembryonicMesoderm)发育而来，但是随着胚外中胚层被分割并与不同的胚胎组织发生相互作用，分布于不同位置的胚外中胚层组织发生了不同的变化，这些变化是否会导致体外分离培养获得的MSC具有不同的生物学特性，进一步深入研究不同来源MSCs生

5、物学特性，将为不同疾病模型的修复提供更有针对性的种子细胞。本研究旨在建立了有效的AMSCs和CMSCs体外扩增体系，比较两群MSCs的生物学特性，并在此基础上，将AMSCs通过立体定向技术注入大鼠局灶性脑缺血MCAO模型(大脑中动脉闭塞脑出血模型，middlecerebralarteryocclusionmodel，MCAO模型)脑内，观察植入细胞的存活、迁移、分化及大鼠神经功能恢复，初步探讨AMSCs移植治疗局灶性脑缺血的作用和可能机制。中文摘要胎盘羊膜和绒毛膜问充质干细胞生物学特性及羊膜间充质干细胞移植修复大鼠局灶性脑缺血的实验研究第一部分AMSCs和CMSCs组织分布及体91、

6、扩增体系的建立目的：分析AMSCs、CMSCs在人胎盘组织中的分布特性、并建立相应的体外扩增体系。方法：取健康产妇正常剖宫产之足月胎儿的新鲜胎盘组织，钝性分离羊膜层与绒毛膜层，采用不同方法对羊膜、绒毛膜组织进行消化及体外培养，倒置显微镜观察体外培养AMSCs、CMSCs的细胞形态；流式细胞仪分别检测其表面标志；采用多种诱导条件分别将两群MSC细胞向脂肪细胞、软骨细胞及骨细胞方向诱导，并用特异性染色法对诱导后细胞进行鉴定。比较多种因子不同浓度下对CMSCs体外扩增效果，选取75ng／mlFL进一步比较其对两群MSC细胞的扩增效果，流式细胞仪检测优化培养条件下培养的两群MSC的细胞表型；

7、细胞计数分析FL对两群MSCs的促增殖作用；RT-PCR分析两群MSC中FL受体nt3基因表达；分别将FL作用下的两群MSC细胞向脂肪细胞、软骨细胞及骨细胞方向诱导，RT-PCR分析脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞特异性基因在诱导后两群MSC细胞中的表达情况。结果：(1)免疫荧光染色显示：羊膜组织中CD90和CDl66阳性细胞主要分布于羊膜上皮和羊膜问质中，而绒毛膜组织中CD90和CDl66阳性细胞主要分布血管内皮下、血管附近间质内；免疫组织切片染色结果显示：羊