腺苷酸环化酶激活剂诱导脆性x智力低下一号基因重新表达的机制研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文腺苷酸环化酶激活剂诱导脆性x智力低下一号基因重新表达的机制研究ThestudyofthemechanismofinductiononsilencedfragileXmentalretardation—-1Genere--expressionbyadenylatcyclaseactivator课题来源：自选课题专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员儿科学池秀芳姚英民教授陈运彬教授崔其亮教授傅万海教授周伟教授黄为民教授论文评阅人钱新华教授傅万海教授2012年5月1日广州／【硕士学位论文腺苷酸环化酶激活剂诱导脆性X智力低下一号基因重新表达的

2、机制研究硕士研究生：池秀芳指导教师：姚英民摘要脆性X综合征[fragileXsyndrome，Fra(X)]是最常见的遗传性智力低下疾病之一。据保守估计，我国至少有20万脆性X病人。目前认为Fra(X)致病机制主要是由于脆性X智力低下一号基因(fragileXmentalretardation-1gene，FMRl)启动子区(CGG)n--核苷酸重复序列的不稳定扩增及其上游的CPG岛的异常甲基化，使FMRl基因转录及翻译终止，其编码产物一脆性X智力低下蛋1兰I(fragileXmentalretardationprotein，FMRP)减少或缺如，最终表现为Fra(X)。目前对于Fr

3、a(X)的治疗尚无有效的方法，基因治疗仍困难重重，药物重新活化FMRl的方法，也因其存在较强的毒副作用制约了临床应用，寻找有效、安全、低／无毒副作用的药物用于治疗Fra(X)仍是目前研究的热点之一。已往很多研究提示智力低下与信号转导通路之间有着某种相互联系，其中，环磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)信号通路与学习记忆和智力关系最为密切，故Fra(X)与cAMP通路之间的关系也引起了人们的密切关注。人们发现在Fra(X)患者细胞中、在FMRl基因敲除小鼠的脑组织及血小板内，以及在患有Fra(X)的果蝇脑组织内cAMP水平均低于正常，而患有Fr

4、a(X)的果蝇可以通过重新植入FMRl基因来弥补这种缺陷，由此提示FMRl基因与cAMP之间可能存在相互调控关系。Fra(X)患者细胞内cAMP水平降低的原因是什么呢?cAMP的代谢主要与腺摘要苷酸环化酶(adenylatecyclase，AC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)的活性有关。前者作用于ATP可生成cAMP，而后者则降解cAMP，以保持胞内cAMP水平的平衡。有临床研究发现一部分Fra(X)患者存在腺苷酸环化酶催化亚单位的功能或者调节的异常。我们前期研究发现FMRl基因封闭后细胞内cAMP水平下降，腺苷酸环化酶活性也明显降低，而磷酸二酯酶的活性则

5、无显著变化。提示FMRl基因的功能缺陷可影响腺苷酸环化酶的活性，推测腺苷酸环化酶活性抑制可能是影响Fra(X)患者细胞内cAMP水平降低的主要原因。如果FMRl基因转录及翻译终止与腺苷酸环化酶活性降低有关，反之，用药物提高腺苷酸环化酶的活性能否重启被封闭的FMRl基因呢?为了证明我们的猜想，前期在封闭的FMRl基因细胞模型上，我们采用特异性腺苷酸环化酶(AC)激活剂药物弗司可林(forskolin，FSK)改善腺苷酸环化酶的低活性状态，结果发现它的确可有效地重新诱导沉默FMRl基因的转录和蛋白表达，但forskolin对FMRl基因调节的具体机制尚不清楚，是否通过提高cAMP水平这一

6、途径诱导的有待进一步证实。已知FMRI基因启动子区与FMRl基因的转录密切相关，该区内存在一个具有增强子活性的甲基化敏感区(methylationsensitiveelemem，MSE)，值得注意的是该区增强子内又同时包含一个cAMP反应单位(cAMP．responsiveelement，CRE)碱基序列，两者结构重叠，关系紧密。而CRE序列是环磷酸腺苷反应单元结合蛋白(CREB)的结合位点。CREB是一种重要的核转录因子，具有调节包括记忆功能在内的广泛的生物学功能，且研究发现CREB可以与FMRl启动子结合并可增强FMRl启动子的活性，因此推测其机制可能是cAMP诱导的。AC激动剂

7、forskolin是否经cAMP通路，通过FMRl启动子区内的MSE／CRE重叠位点实现对FMRl基因调节的尚有待证实。为了证实以上推测，本研究1．拟直接采用外源性cAMP药物-二丁酰环磷酸腺苷(db．cAMP)诱导沉默FMRl基因的转录和蛋白表达，试图证实forskolin是通过提高细胞内cAMP水平这一途径而达到对FMRl基因再激活作用的；2．以Ⅱ硕士学位论文MSE／CRE位点为研究靶点，构建FMRl启动子区MSE／CRE位点双荧光素酶报告基因系统，在