猪巨细胞病毒gb基因克隆、原核表达及抗血清的制备

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1、猪巨细胞病毒gB基因克隆、原核表达及抗血清的制备CloningandexpressionofporcinecytomegalovirusgBandpreparationofpolyclonalantibodies硕士研究生：王慧导师：徐建生教授扬州大学2012年6月王慧：猪巨细胞病毒gB基冈克隆、原核表达及抗血清的制备!中文摘要猪巨细胞病毒感染(porcinecytomegalovirusinfection，PCMVI)是一种条件性传染病，由疱疹病毒科p-疱疹病毒亚科的猪巨细胞病毒(porcinecytomegalovirus，PCMV)弓]起。该病于1955年首次在英国发现

2、，在猪群中广泛流行，凡是有猪只饲养的地区，都有可能感染本病毒。欧洲、北美、和日本PCMV的血清抗体阳性率为90％以上，在感染猪群中，98％的猪血清抗体为阳性。根据GenBank中发表的猪巨细胞病毒基因组序列的分析，设计引物对PCMV进行PCR检测。通过相关参考文献建立的PCR、RT-PCR方法，对猪相关发热病病原中的猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PR

3、V)、猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)等主要病毒的感染情况进行检测，以便探究PCMV与猪发热病的关系。采集来自江苏扬州、盐城、宝应、靖江等地区的200份商品猪鼻拭子，26份病猪鼻拭子及各脏器病料进行检测，结果发现：在采集的200份商品猪鼻拭子中，东台猪场PCMV的检测阳性率为9％(9／100)：宝应猪场PCMV的检测阳性率为31％(31／100)；在26份鼻拭子和病料中有14份检出PCMV，阳性率为53．8％；其中鼻拭子检出率为38．5％，病料检出率为15．4％；PCMV和PRRSV混合感染的阳性率最高，26份病料中有12份，混合感染率为

4、46．2％；其次是PCMV与PCV02的混合感染，26份中有6份，阳性率为23．1％；与CSFV的混合感染率为4％；有4份为PCMV、PRRSV和PCV2的三重感染，占总数的15．4％：另有1份为PCMV、PRRSV与CSFV的三重感染。PCMV与引起猪发热病的病原的相关性较高。用上述PCMV引物对样品进行PCR检测，经测序后与GenBank的PCMVgB基因进行同源性比较，结果同源性在98．0％～100％之间，应用MEGA5．05软件对gB基因的序列进行了遗传进化树分析。PCR扩增gB基因并回收，将其克隆入载体质粒pUCm-T，将目的片段与原核表达载体pGEX．6p．1连接

5、，转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导，由SDS—PAGE电泳分析证实妒基因获得了表达，重组蛋白分子量分别约为48Ku，命名为GST-gB。重组蛋白GST-gB以包涵体的形式存在。以抗PCMV血清为一抗，经Western．blot分析证实表达的融合蛋白抗原性良好。用重组菌(PGEX．gB)诱导表达融合蛋I兰t(GST-gB)，经过纯化后的蛋白作为免疫原，免疫3kg左右的新西兰兔2只。三次免疫后用间接ELISA方法检测抗体效价，抗体的有效稀释效价可达到1：25600。制备高效价的抗体是验证基因表达和研究基因功能的首要前提，目前诊1扬州大学硕士学位论文断PCMV感染

6、的方法主要是传统的血清学诊断法及后来发展的PCR方法，因此对其基因进行抗原性分析及制备GST-gB抗体可促进相关研究的开展。关键词：猪巨细胞病毒；gB基因；克隆表达；抗血清王慧：猪巨细胞病毒gB基因克隆、原核表达及抗血清的制备Abstract3一Porcinecytomegalovirusdisease(PCMVI)isanopportunisticinfectioncausedbyporcinecytomegalovirus(PCMV)．PCMVisabetaherpesviruswhichcausesgeneralizedinfectioninnewbornpiglets

7、．Ithasaworldwidedistributionandispresentin90％ofherdsintheUnitedKingdom，manyofwhicharefromwell-managed，high—healthstatusfarms．ThediseasewasfirstdiscoveredinUKin1955．PresentlyPCMVisfoundthroughouttheworldandinfectionisubiquitouswithherdprevalencegreatertha