载脂蛋白m基因启动子的克隆及功能初步研究

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1、贵阳医学院2012届硕士研究生论文《中国图书资料分类法》单位代码：10660分类号：R34学号：S090089贵阳医学院2012届硕士学位论文载脂蛋白M基因启动子的克隆及功能初步研究研究生：赵峻英导师：黄韵祝教授年级：2009级专业：临床检验诊断学2012年5月9日1贵阳医学院2012届硕士研究生论文目录摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„23讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„30结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„

2、„„„„33参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„34英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„36致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„38略缩词表„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„39学位论文原创性声明„„„„„„„„„„„„„„„„40附：综述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„412贵阳医学院2012届硕士研究生论文载脂蛋白M基因启动子的克隆及功能初步研究专业：临床检验诊断学研究生：赵峻英导师：黄韵祝教授摘要目的：克隆apoM基因的上游启动子序列，构建不同启动子截短片段的荧光素酶报告基因，并观察其不同截短片段的启动子活性，为研究该基因的表达调控机

3、制奠定基础。方法：首先应用5’RACE(rapidamplificationofcDNAends，cDNA末端快速扩增)技术确定了apoM基因的转录起始位点，以HepG2基因组DNA为模板，通过PCR扩增方法获得一系列不同大小的apoM启动子片段，将扩增的不同大小的启动子片段与pMD19-T载体连接进行T-A克隆，鉴定出正确的克隆后，再用加在引物上的XhoⅠ和HindⅢ酶切位点所对应的内切酶酶切，将酶切所得的目的片段定向克隆入经同样酶切的pGL3-Basic载体中，构建荧光素酶报告基因载体，在阳离子脂质体的介导下，报告基因载体瞬时转染HepG2细胞，并观察其不同截短片段的启动子活性。结

4、果：1、5’RACE技术确定了apoM基因的转录起始位点。2、用PCR和酶切方法得到了不同长度的apoM基因启动子区域的片段。3、成功构建了不同长度的apoM基因启动子区pGL3-Basic重组质粒。4、pGL3-Basic-B的荧光素酶活性与pGL3-Basic-A荧光素酶活性相比有所升高，差异无统计学意义（p>0.05）；pGL3-Basic-A和pGL3-Basic-B的荧光素酶活性值低于pGL3-Basic空载体；pGL3-Basic-C的荧光素酶活性与pGL3-Basic-B的的荧光素酶活性相比显著升高，两组比较p<0.01；pGL3-Basic-D的荧光素酶活性与pGL3-

5、Basic-C相比明显降低，两组比较p<0.01；pGL3-Basic-E的荧光素酶活性与pGL3-Basic-D的荧光素酶活性相比明显升高，两组比较p<0.01；pGL3-Basic-F的荧光素酶活性与pGL3-Basic-E的荧光素酶活性相比有所升高，差异无统计学意义（p>0.05）。3贵阳医学院2012届硕士研究生论文结论：1、apoM基因的转录起始点为“A”，位于翻译起始点前52bp处。2、apoM基因转录起始点上游约400bp的序列没有启动子活性。3、-401~-621bp可能是apoM基因的核心启动子区，存在增强转录的重要调控元件。4、推测在-621~-929bp之间可能存

6、在抑制转录活性的负调控区。-929~-1110bp之间存在增强转录的正性调控区域，-1110~-1335之间无明显增强转录的调控区域。关键词：载脂蛋白M；启动子；报告基因4贵阳医学院2012届硕士研究生论文前言脂代谢紊乱也称血脂异常(dyslipidemia)，作为原发病因或继发性疾病与全身各个系统疾病的发生、发展及其预后等有着密切的关系。不仅是动脉粥样硬化、脑卒中、高血压、冠心病等心脑血管疾病的危险因素，而且对冠心病（CHD）急性事件（冠脉猝死、急性心肌梗死和不稳定性心绞痛）的发作起重要作用，同时还与糖尿病、肾病、肝病、肿瘤及代谢综合征等诸多重大疾病密切相关。载脂蛋白（apo）为构成

7、血浆脂蛋白的主要成分,是一类能与血浆脂质结合的蛋白质，参与了体内血脂的代谢和调节。载脂蛋白M(apolipoproteinM,apoM)是一种新近发现的载脂蛋白，主要存在于高密度脂蛋白（HDL）中，少量存在于[1]富含三酰甘油的脂蛋白(TGRLP)和低密度脂蛋白(LDL)中，并认为apoM在HDL[2]代谢及抗动脉粥样硬化(AS)中发挥重要作用。其基因定位于6号染色体主要组织相容性复合物Ⅲ区，apoM基因的表达具有组织特异性，主要表达于肝实质细