人脐带间充质干细胞治疗at1-aa诱导的妊娠期高血压疾病大鼠的潜能及机制研究

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1、中国医科大学博士学位论文人脐带间充质干细胞治疗AT1--AA诱导的妊娠期高血压疾病大鼠的潜能及机制研究姓名：张丹申请学位级别：博士专业：妇产科学指导教师：尚涛201204·中文论著摘要·脐带问充质干细胞改善血管紧张素受体自身抗体所诱导的妊娠期高血压疾病的潜能及机制的研究背景妊娠期高血压疾病(Hypertensivedisordercomplicatingpregnancy,HDCP)是导致孕产妇及围生儿死亡的主要疾病，其病因和确切的发病机理目前仍不清楚。目前大多数学者认为子痫前期的发病与妊娠期间母体对于来自父系抗原的免疫适应不良引起胎盘缺氧，胎盘细胞滋养细胞浸润能力异常，螺旋动脉重塑障碍

2、、胎盘组织合成和释放大量细胞因子进入母体循环引起一氧化氮(nitricoxide,NO)活性下降，活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)增加、进而导致肾脏功能受损，外周阻力增加丽引起高血压。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)因具有免疫调节作用而起到维持免疫耐受的作用。异基因的胎儿被认为是异基因的移植物，维持妊娠的相关耐受机制与移植耐受机制相似。目的研究脐带来源的间充质干细胞(humanumbilicalcord-derivedmcsenchymalstemcells，HU-MSCs)对血管紧张素受体自身抗体诱导的妊娠期高血压疾病模型

3、大鼠的治疗作用及机制，为HU-MSCs对妊娠期高血压疾病的临床治疗提供理论依据和实验基础。方法i、建立酶消化法和组织块培养法分离培养HU-MSCs，对细胞的一般形态、免疫表型进行鉴定，应用含绿色荧光蛋白的慢病毒(1entiviralgreenfluorescenceprotein，LV-GFP)转染HU-MSCs，免疫组化方法检测血红素氧化酶1(heineoxygenasel，HO·1)在HU-MSCs中的表达情况。2、大鼠源性的血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensinIItypelReceptor,ATlR)第二胞外环的多肽片段偶联血蓝蛋白(Keyholelimpethemocya

4、nin,KLH)制备免疫原对大鼠进行免疫16W，使用溴化氰活化琼脂糖凝J菠4B(Sepharose4BCNSr)亲和纯化血管紧张素受体自身抗体(Angiotenstnreceptoragonisticautoantibodies,ATl叫～A)，采用心肌跳动频率的变化鉴定所得的抗体，HE染色和PAS染色观察肾脏的病理改变。3、大鼠妊娠12d和14d尾静脉注射ATl-AA,造成妊娠期高血压疾病大鼠模型。ATl-AA注射半天后，将注射ATI．AA的妊娠大鼠随机分成两组：接受H13-MSCs的治疗组(ATl．AA+MSCs组，n-7)和未治疗组(ATI-AA组，n-7)。对照组为在相应妊娠天数

5、注射0．9％生理盐水的正常妊娠大鼠(NP组，n=6)。应用免疫荧光切片技术检测注射后的LV-GFP标记的HU-MSCs在大鼠肾脏、胎盘和三角区以及胎鼠心脏、肺脏、肾脏和肝脏中的分布。妊娠第ll、15和19d采用无创尾静脉大鼠血压仪检测大鼠血压。妊娠第20d处死大鼠，检测删．MSCs对胎鼠体重，胎鼠肾脏和肝脏发育情况，大鼠肾脏病理，螺旋动脉重塑的影响，并且检测肿瘤坏死因子a(tumornecrosisa，TNF-仅)、自介素10(interleukin10，m-10)和HO-l因子的变化。结果匀日7卜l、HU-MSCs呈现出成纤维样的形态。应用LV-GFP转染FlU，MSCs72h后转染率

6、达踟％以上。流式细胞仪检测FlU．MSCs免疫表型，结果显示各代细胞均表达CD73、CD90和CDl05不表达表面标记CD34、CD45、CDl9，CDll和H1A-DR。删．MSCs的细胞质内存在HO-1的强烈表达。2、应用心肌细胞跳动频率检测ATI-AA的活性表明，ATl-AA(1：50)能够引起心肌跳动频率显著增加(11．36±2．49bpm)，氯沙坦(1．0弘mot／L)能够阻断ATl·AA引起的心肌跳动频率增加(1．29±1．77bpm)，这说明提取的ATl-AA具有活性。3、通过给予健康SD大鼠尾静脉注射ATl-AA造模后，在妊娠第19d，An．AA组大鼠血压较NP组显著升高

7、，经统计分析P<0．05，有统计学意义；ATl硝A组大鼠肾脏出现损伤、螺旋动脉重塑障碍；A：rl-AA组胎鼠体重较NP组显著下降，经统计分析P