可溶性全长hpparγ重组蛋白的制备及其活性研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文可溶性全长hPPARγ重组蛋白的制备及其活性研究姓名：夏铸申请学位级别：硕士专业：药物化学指导教师：余瑜201205重庆医科大学硕士研究生学位论文可溶性全长hPP削脚重组蛋白的制备及其活性研究摘要PPf气R了(peroxisomeproliferatoractivativedreceptor丫，过氧化物酶体增殖物激活受体)是核激素受体超家族中的非常重要成员之一，除在脂肪组织中高表达外，在肺、结肠、乳腺、卵巢等组织也有不同程度的高表达。PPARY既可参与调控细胞内脂肪代谢和糖代谢，又可抑制肿瘤细胞增殖、分化以及促进细胞

2、凋亡、转运等。因此，P呐是肿瘤细胞信号传导途径中的重要靶点蛋白，现已成为热点研究的核受体之一。外源性制备hP呐重组蛋白(HumanPeroxisomeproliferator-activatedreceptor丫)，能够为其相关分子靶向药物的筛选打下坚实的基础。为此，本文拟制备可溶性全长hP呐重组蛋白，并对其活性进行研究，其主要研究内容及结果如下：1．采用带有六个组氨酸[His】6的泛素化小修饰蛋白(SUMO)为融合表达标签，设计并构建可溶性全长hP呐重组蛋白的表达质粒pReceiver_Bl3．S切ⅥO．11PP岫，经质粒转化，细菌培养，

3、在优化条件(16℃、IPTG浓度O．5mM、诱导时间20h)下，表达出可溶性全长[His】6．S切ⅥO．11PP√埘重组蛋白，经SDS-PAGE电泳分析，与IlP呐蛋白的理论分子量(67．2l(Da，包括[His]6一SUM0)是一致的。2．采用Ni2+亲和色谱柱于变性条件下一步纯化目标蛋白，优化纯化条件，可获得纯度为90％的全长【His】6一SUMO．11PP舢Ⅵ变性重组蛋白。变性目标蛋白经透析复性后，能获得可溶性全长[His]6-SUM0-hP呐4重庆医科大学硕士研究生学位论文重组蛋白。3．利用DEAE一52阴离子交换树脂在非变性条件下

4、一步纯化目标蛋白，用NaCl溶液梯度洗脱目标蛋白，从每升LB培养介质中可获得135mg、纯度为80％的可溶性全长[His]6．SUMO—hP蛐重组蛋白。4．采用分子排阻色谱．高效液相色谱法(sizeexclusioncllromato．graI)hy-hi曲perfonnancec11romatography，SEC一}丑?LC)，测定了全长[His]6-S切Ⅵ0-llP岫重组蛋白与Ros(Rosiglitazone，罗格列酮)配体结合活性，其Kd值为492nM，结合率约为70％。综上所述，本文建立以带有【His]6组氨酸的泛素化小修饰蛋白

5、为融合表达标签的质粒、重组表达、纯化得到具有生物学活性的可溶性全长[His]6一SUMO—hPP舢Ⅵ重组蛋白的制备方法，采用DEAE一52阴离子交换树脂一步纯化法，从每升培养液中可制备得到135mg、纯度为80％的全长阻is】6一S切ⅥO—hP岫重组蛋白。为建立基于全长hPP舢Ⅺ重组蛋白为作用靶点蛋白的抗肿瘤药物筛选平台奠定了基础。关键词：hPPA砷，可溶性重组蛋白，全长hP脚重组蛋白，制备，活性重庆医科大学硕士研究生学位论文STUDYoNPREPARAI’IoNANDACTIVITYoFSOLUBLEFULLLENGTH小MANPPAR丫

6、RECOMBINANTPROTEINABSTRACTPeroxisomepr01iferatoractiVatiVedreceptors(PPARs)areoneoftheirnpoIrtammemberofthenuclearho姗onereceptorsuperf．amily．InadditiontohighexpressioniIladiposetissue，PPAR了，alsohaVedifrerent锄ountsofexpressioninthelung，breast，oVarian，c010no唱anizationsfordi虢

7、rent．Pnj_[Ⅵnotonlyparticipateintheregulationofintracellularf-atmetabolism，glucosemetabolism，butalsoinhibittumorcellpr01iferation，differentiationandpromote印optosis，transporrtation．PⅣU叶isanimportantta玛etproteinofthesignaltransductionpathwayintumorcellsandsoitbecomesoneofthem

8、oststudiednuclearreceptors．PreparationofexogenousPnU叶recombinantprotein，couldlayasolidfou