松材线虫运动行为及其神经递质乙酰胆碱的相关研究

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1、山东农业大学硕士学位论文松材线虫运动行为及其神经递质乙酰胆碱的相关研究姓名：齐文静申请学位级别：硕士专业：植物病理指导教师：刘振宇20120615山东农业人学硕I：学位论文中文摘要松材线虫病，又称松枯萎病，是世界上最具危险性的林木病害，其病原松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)是重要的检疫性有害生物。目前该病在日本、韩国、美国和中国等地都有分布，但危害程度不一。松材线虫是一种迁移性线虫，其寄生与致病特征与其运动行为密切相关，而运动行为是受神经系统调控的。本研究围绕松材线虫的运动行为及神经递质乙酰胆碱，开展了一系列工作。本研究首先对来自山东威海黑松、浙江宁波马尾松、浙

2、江杭州马尾松以及陕西柞水油松的松材线虫进行了鉴定，保存为BXRCl、NXY61、NXY67和BXZS株系。测定了在PDA．灰葡萄孢上培养时的繁殖力，以及在黑松等寄主树种枝条内的迁移力特征。结果证明，三个虫株的繁殖能力依次为NXY61、NXY67和BXRCI。在黑松、赤松和华山松枝条中BXRCI的迁移力是最强的，在油松枝条中NXY67的迁移力是最强的，而在白皮松和雪松枝条中三个虫株的迁移力都相对较弱。基于乙酰胆碱作为神经递质的神经生物学特征，本文研究了抗胆碱药和抗胆碱酯酶药对松材线虫自由运动行为的影响。通过显微镜观察用抗胆碱药硫酸阿托品(Atropinesulfate)处理的松材线虫自由运动行

3、为的变化，发现松材线虫幼虫和成虫行为的异常，一般表现为活动的减慢，包括头部摆动频率和身体弯曲频率的减小，身体的不正常扭动，多呈螺旋状卷曲或多节卷曲，而正常松材线虫在液体中的扭动会呈大的S形。观察抗胆碱酯酶药甲硫酸新斯的明(Neostigminemetilsulfate)对松材线虫自由运动行为的影响，发现甲硫酸新斯的明对松材线虫的头部摆动频率和身体弯曲频率并无明显的影响，但可看到线虫摆动幅度的增大，摆动速度的加快等特点，所以线虫总体消耗的能量是增大的，这符合抗胆碱酯酶药物对于神经系统的兴奋性。此外，还克隆了BXRCI松材线虫株系的神经系统相关基因乙酰胆碱酯酶基因ace．J，经分析该基因包含l8

4、69bp完整的ORF序列，包括起始密码子ATG和终止密码子TAG，编码了622个氨基酸，预测的蛋白质分子量为71．231kDa，等电点为5．56。利用GenBank中的BLAST与其他松材线虫及其他物种的ace．，序列进行比对，发现该基因同GenBank中登录号为GUl66345的ace．J序列相似度为99．89％，推导的蛋白质序列同相似度为99．84％，与来自胎生网尾线虫(Dictyocaulusviviparus)，秀丽隐杆线虫(Caenorthaditselegans)等物种的类似序列的相似度为57．06％到99．89％。松材线虫运动行为及其神经递质乙酰月u碱的相关研究采用MEGA4．

5、1neighbor-joining(NJ)法构建氨基酸系统进化树，结果表明：BXRCl虫株与GenBank上登录号为GUl66345的ace．J序列所属的虫株遗传距离非常近，为同一种，同为松材线虫。BXRCl虫株乙酰胆碱酯酶与甘薯茎线虫(Ditylenchusdestructor)、南方根结线虫(Meloidogyneincognita)和爪畦根结线虫(M．javanica)的乙酰胆碱酯酶属于同～个分支，BXRCl．ACE．1与这些线虫乙酰胆碱酯酶的同源性分别为71．86％、67．83％和67．22％。关键词：松材线虫，运动行为，乙酰胆碱，乙酰胆碱酯酶基因山东农业人学颂I：学位论文Abstr

6、actPinewoodnematodediseaseisthemostdevastatingdiseaseofpinetrees．ItspathogenBursaphelenchusxylophilusisakindofquarantinablepest．ThisdiseasedistributesinJapan，Korea,America,Canada，MexicoandPortugal，andSOon．InChinaitisfirstdiscovedinNanjingprovince，andthenspreadedtootherprovinces．丑xylophilusisakindof

7、migratorynematode．ThemovementofB．xylophiluswhichiscontrolledbynervoussystemrelatedtotheparasitismandpathogenicityofthenematodes．BasedonthestudyofthemovementofB．xylophilusandtheacetylcholineasneurotransmitte