甲嘧磺隆的微生物降解作用研究

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1、河北农业大学博士学位论文甲嘧磺隆的微生物降解作用研究姓名：康占海申请学位级别：博士专业：农药学指导教师：张金林20120518摘要利用生物修复法来降低环境中的农药是行之有效的措旋之一，在诸多的农药生物修复方法中以微生物修复的研究和应用最为广泛，尤其微生物修复环境中长残效农药的研究较多。甲嘧磺隆是一种超高效、广谱、持效期长的磺酰脲类除草剂，在世界范围内广泛应用于林业及非耕地杂草的防除。甲嘧磺隆性质稳定、不易降解、在环境中持效期长，因此对敏感作物很容易造成药害。甲嘧磺隆的水溶性较高，在土壤中的移动性较强，易造成对地下水的污染，因此，对甲嘧磺隆微生物降解作用的研

2、究具有一定的实践意义。而关于甲嘧磺隆的微生物降解作用研究鲜见报道，本研究通过富集培养的方法从土壤和水中分离筛选出19株可降解甲嘧磺隆的微生物，对其中降解能力较强的JH2和JH3菌株进行了降解特性及降解机理研究，主要研究结果如下：1．降解甲嘧磺隆微生物的筛选。利用富集培养技术从生产甲嘧磺隆农药厂的废水中分离得到了19株能够降解甲嘧磺隆的微生物，通过测定不同菌株对甲嘧磺隆的降解率发现：供试菌株对低浓度甲嘧磺隆的降解率要显著高于高浓度的降解率，在培养基中甲嘧磺隆的含量为5mg．L。1时，JH3菌株的降解率最高，为98．9％，其次是JH2菌株，降解率为95．3％。

3、对其中降解作用较强的7个菌株进行鉴定，其中JH3菌株为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)；JH2菌株为食酸丛毛单胞菌(Delftiasubsp)；JHl0菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；JH6菌株为解淀粉芽孢杆菌(BacillUSamyloliquefaciens)；SH3菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；SH5菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；SH4菌株为沙门氏菌(salmonellasp．)。2．JH2、JH3菌株的降解特性及降解机理研究。结果表明，JH2菌

4、株的最适降解培养基为基础培养基III，以甲嘧磺隆浓度为5mg·L‘1时JH2、JH3菌株降解率最高；JH2菌株对甲嘧磺隆降解的适宜温度为300(2，JH2菌株接种量为l×108CFU·mL～，转速为150r·min-1，培养120h对甲嘧磺隆的降解率最高：JH3菌株对甲嘧磺隆降解的适宜温度为35℃，接种量为1×107CFU·mL～，转速为150r·min～，培养72h时对甲嘧磺隆的降解率最高；通过对JH2、JH3菌株进行作用机理研究，两菌株降解产物的特征峰基本相同，降解产物的主要碎片离子为m／z198、分子式为C8H704S的化合物，其紫外检测的保留时间为

5、3．0min，推断甲嘧磺隆结构式中的另一半结构可能降解为链状烷烃，没有紫外吸收，也不能离子化，因此没有特征峰。以此判断JH2、JH3对甲嘧磺隆降解的作用位点在S-N键。3．JH2、JH3菌株降解酶活性研究。通过JH2、JH3菌株对甲嘧磺隆降解酶定域表达试验表明，两菌株的胞内酶和胞外酶均有活性，降解甲嘧磺隆的关键酶都主要是胞外酶且降解酶诱导表达。在LB液体培养基中，当甲嘧磺隆浓度为5mg·L～、接种量为2．3x108CFU·mL～、初始pH值为8．O、温度30℃、转速为150r·min～、培养时间120h时JH2菌株胞外粗酶的酶比活最高达到85．8U·mg～

6、；其酶促反应体系的甲嘧磺隆最适浓度为5mg·L一、温度30℃、pH值为8．0时胞外酶对甲嘧磺隆的降解率最大为86．9％。在LB液体培养基中，当甲嘧磺隆浓度为5mg·L～、接种量为2．3x10‘7CFU·mL～、初始pH值为9．0、温度35℃、转速为150r·min一、培养时间72h时JH3菌株胞矫粗酶麴酶眈活最高达到88．4U·mg"1；酶促反应体系的甲嘧磺隆最适浓度为5mg·L一、温度35℃、pH值为9．0时胞外酶对甲嘧磺隆的降解率最大为91．3％。两菌株学噻磺隆降解酶在25℃～钙℃范圈内热稳定牲较好，趟值为7～9碱性条件下麓够保持较高降解活性。4。JH

7、2、JH3菌株降鳃甲瞳磺隆活性酶的纯化。胞外粗蛋囱经过DEAESepHaroseFastFlow溺离子交换柱分离，在280nm下JH2菌株得到5个蛋盘吸收蜂，降解圈法检测发现3个洗脱峰P1．1、P1．3、P1．5均有降解活性；JH3菌株得到2个蛋臼吸收峰，降解圈法捡测发现仅p2．2洗脱峰具有降解灞性；SDS。PAGE邀泳检测P1。1、P1—3、pl-5和p2．2的分子量分别是43kDa、32kDa、15kDa和46kDa。将晕嘧磺隆降解酶p1．1、P1．3、P1。5和P2．2利用生物质谱技术测定了氨基酸序列，得到4种降解酶分别为：信号转导组氮酸鬣囱激酶、预

8、苯酸脱氢酶、未知蛋岛和糖基转移酶。根据得到的编码氨基酸的基因序列设