盾壳霉腺苷酸环化酶基因(cmac)功能初步分析

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1、华中农业大学硕士学位论文盾壳霉腺苷酸环化酶基因（CMAC）功能初步分析姓名：夏菲申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：姜道宏201206盾壳霉腺苷酸环化酶基因(CMAC)功能初步分析捅姜盾壳霉(Coniothyriumminitans)是核盘菌的重寄生菌，是作物菌核病的重要生防真菌。本实验室在前期对emPrat基因进行了研究，推测在盾壳霉寄生核盘菌的过程中从寄主中获取次黄嘌呤或与次黄嘌呤相关的活性物质，如cAMP。细胞内的cAMP可由腺苷酸环化酶(AC)催化形成，腺苷酸环化酶是cAMP信号系统中的重要组成部分。在真核生物中，外部信号从细胞膜外传递到细胞核内进而影

2、响基因的转录变化，涉及许多信号通路，cAMP信号途径是其中的重要途径。cAMP信号系统在真菌的生长发育和致病方面都起到了重要的调控作用，研究盾壳酶的cAⅧ信号系统在理论和实践方面都有重要的意义。通过酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的腺苷酸环化酶的氨基酸序列对盾壳霉ZS．1菌株的基因组数据库进行BLAST分析，得到了编码腺苷酸环化酶的基因，将其命名为CMAC，对其基因序列进行分析。CMAC基因序列令长为6908bp，编码2114aa的蛋白质。在softberry上分析，该基因包含有4个外显子和3个内含子。将其氨基酸序列在NCBI上进行比对，发现

3、它与许多真菌的腺苷酸环化酶基因有很高的相似性，其中与小麦德氏菌和核盘菌的相似度分别达80％矛H67％。细胞内的cAMP主要是由腺苷酸环化酶(AC)水解ATP生成的。为了了解cAMP．PKA信号系统在盾壳酶中所起到的作用，对盾壳霉营养生长和致病力方面的影响，应用农杆菌介导转化的方法(ATMT)对其基因CMAC进行敲除，获得了CMAC的敲除转化子K086和K0245，RT-PCR结果显示基因CMAC在盾壳酶ZS．1内各个时间段rfl均有表达，基因敲除后不表达。与出发菌株ZS．1相比，转化了生长十分缓慢，但菌丝浓密且向培养基内部生长，气生菌丝不发达。菌丝顶端分支模式发生改变

4、，分支增多且呈直角。菌落边缘不规则，缺少黑色素，产孢量明显减少，分生孢了器比较硬，在生长后期分泌的粘液很少。经敲除转化-了寄生后菌核腐烂程度都只有一级，与出发菌株ZS．1相比有显著差异(P<0．01)，敲除CMAC基因后使得盾壳酶基本上丧失寄生菌核的能力。研究结果表明盾壳酶中基因CMAC对菌丝的生长、产孢量、孢_了的萌发及寄生菌核等方面有重要的调控作用。敲除转化子在与核盘菌菌丝接触一段时间后，菌丝生长旺盛，中央接种的转化子四周接触的核盘菌提前形成了一圈菌核，与灭活的核盘菌EP一1A367对峙时，其对峙情况不会出现上述的现象。同时，敲除转化予寄生菌核后菌丝的营养生长得到

5、促进，在菌核表面生成厚密的白色菌丝，但是孢子形成没有得到恢复。实验结果表明基因CMAC的敲除转化子在与核盘菌接触后从对方处夺取了1些代谢产物，可以初步确定敲除转化予在与核盘菌接触的过程中夺取了对方的cm]VIP，部分恢复了自华tI，农业大学2012届硕士学位论文身的营养生长，同时在丧失cAMP后，核盘菌菌核生成得到促进。本文对盾壳酶中cAMP信号系统进行了初步分析，为研究该通路在盾壳酶与核盘菌互作中所起的作用提供了基础。关键词：盾壳霉；核盘菌；腺苷酸环化酶；cAMP信号系统盾壳霉腺苷酸环化酶基因(CMAC)功能初步分析ABSTRACTConiothyriumminit

6、ansisasclerotialmycoparasiteoftheplant—pathogenicfungusSclerotiniasclerotiorum，itisanimportantbiocontrolagentagainstScleroiniaSC彪rotiorum．InpreviOUSstudies．wesuspectedthatCminitanscouldobtainactivesubstancelikehypoxanthineorthatwasrelated、历廿lhypoxanthinefromthehostintheprocessofparasiti

7、zingsclerotiatowhichcAMPbelonged．IntracellularcAMPCanbeformedbythecatalysisofadenylateeyclase(AC)，andadenylatecyclaseisanimportantcomponentofthecAMPsignalingsystem．Ineukaryotes，manysignalingpathwaysareinvolvedintheprocessofothergenes，transferringextemalsignalstothenucleusthroug