精氨酸对乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响及其调控机制

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1、精氨酸对乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响及其调控机制研究生：徐柏林导师：王洪荣教授(扬州大学动物科学与技术学院，225009)摘要该研究以体外培养的中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞(CCMEC)为试验模型，研究培养基中不同水平精氨酸(Arg)对乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响，在此基础上，进一步研究Arg影响酪蛋白合成的机制，分别从细胞增殖水平，乳酪蛋白基因、酪蛋白合成信号转导相关基因mRNA转录水平等方面来进行初步探讨。旨在得出Arg影响乳酪蛋白合成的一般规律，筛选出酪蛋白最大合成量时Arg的浓度；揭示Arg影响酪蛋白合成的细胞分子机制，以为提高牛奶中乳蛋白含量、改善牛奶质量提供理论依据。研究包

2、括四个部分：试验一奶牛乳腺上皮细胞的体外培养该试验以健康的中国荷斯坦奶牛的泌乳期乳腺组织为试验材料，采用胶原酶消化法在体外培养得到奶牛乳腺上皮细胞，根据成纤维细胞和乳腺上皮对胰蛋白酶的敏感性不同进行奶牛乳腺上皮细胞的纯化，对分离纯化的细胞进行传代、冻存与复苏。并对得到的细胞进行形态学、生长特性、免疫组织化学、生物学功能的鉴定。利用台盼蓝计数法绘制细胞生长曲线，采用免疫组化法对上皮细胞特异性蛋白CK一18的表达进行鉴定，采用RT—PCR技术对乳腺上皮细胞内编码酪蛋白合成的基因CSNlSl、CSNlS2、CSN2、CSN3的表达进行检测。结果显示：分离得到的细胞呈鹅路石样，细胞之间连接紧密且

3、界限清晰，单层生长；细胞生长曲线呈S形，具有明显的潜伏期、指数生长期、平台期，细胞于第三天进入指数生长期于第七天进入平台期，符合一般的细胞生长规律；CK一18的免疫组化鉴定结果呈现出强阳性，说明分离得到的细胞属典型的上皮细胞；RT—PCR结果显示，CSNlSl、CSNlS2、CSN2、CSN3基因在细胞内均能有效的表达，说明分离得到的细胞具有乳腺上皮细胞的特异性生物功能。试验二精氢酸对乳腺上皮细胞内酪蛋白合成的影响该试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为试验模型，研究培养基中不同水平的Arg对奶牛乳腺上皮细胞内QS、13一酪蛋白合成的影响。试验采用单因素7水平完全随机试验设计，以无Arg的培

4、养基即Arg0倍组(0．00mg／L)为对照，Arg0．25倍组(69．500mg／L)、0．5倍组(139．00mg／L)、1倍组(278．00mg／L)、2倍组(556．00mg／L)、4倍组(1112．00II—mg／L)、8倍组(2224．00mg／L)为试验处理组，采用ELISA双抗夹心法对各个组的细胞内QS、D一酪蛋白合成量进行测定。结果显示：对于Qs一酪蛋白，除了Arg0．25倍组与Arg8倍组，各处理组与对照组相比差异显著(P<0．05)，且在Arg2倍组时Qs一酪蛋白的合成量达到最大；对于B一酪蛋白，除了Arg0．25倍组，各个处理组与对照组相比差异显著(P<0．05)

5、，且在Arg2倍组时B一酪蛋白的合成量达到最大。试验三精氨酸对乳腺上皮细胞生长及增殖的影响该试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究培养基中不同水平的Arg对奶牛乳腺上皮细胞生长以及细胞增殖活性的影响。试验设计同试验二。采用台盼蓝计数法绘制不同处理组的细胞生长曲线，采用噻唑蓝(MTT)法分别检测各个处理组的24h、48h、72h的细胞增殖活性。结果显示，各个处理组的细胞生长曲线均呈S形，在第三天达到指数期，第七天进入平台期，进入平台期后Arg2倍组的细胞数目高于其他各组；MTT结果显示，24h时，Arg0．25-4倍组与对照组相比均差异显著(P<0．05)；48h、72h时，Arg各

6、组与对照组相比均差异显著(P<0．05)。说明精氨酸能促进乳腺上皮细胞的增殖，且在Arg浓度为69．50—1112．00mg／L(0．25倍组一4倍组)时促增殖效果较佳。试验四精氨酸对乳腺上皮细胞内酪蛋白合成以及信号转导相关基因表达的影响该试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究培养基中不同水平的Arg对奶牛乳腺上皮细胞内编码乳酪蛋白合成的基因CSNlSl、CSNIS2、CSN2、CSN3以及与乳蛋白合成有关的JAK2／STAT5、mTOR信号通路上相关基因JAK2、STAT5、mTOR、S6K、4EBPl的表达的影响。试验设计同试验二。以GAPDH为内参，采用Real-TimePC

7、R技术检测各个处理组的CSNlSl、CSNlS2、CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、mTOR、S6K、4EBPl基因的相对表达量。结果显示：对于CSNlS2、CSN2、JAK2基因，除了Arg0．25倍组与Arg8倍组外，其他各处理组与对照组相比显著上调其表达(P<0．05)，对于STAT5、mTOR基因，除了Arg8倍组外，各处理组与对照组相比显著上调其表达(P<0．05)，对于S6K基因，除了Arg0．5倍组外，其他各各