肠杆菌科细菌碳青霉烯酶基因blakpc-2的质粒定位及遗传环境

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1、河南农业大学硕士学位论文肠杆菌科细菌碳青霉烯酶基因blakpc--2的质粒定位及遗传环境姓名：赵磊申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：杜向党201206河南农业大学2叭2届硕士学位论文摘要碳青霉烯酶是指能够水解弧胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的B一内酰胺酶。除了水解碳青霉烯类抗生素，大部分酶还可以水解头孢菌素汞I青霉素类抗生素。因此，深入了解碳青霉烯酶基冈在肠杆菌科细菌的流行状况及扩散机制，在临床抗感染治疗领域上具有重要的实际意义。本研究白2009年5月一2010年】1月从河南省某医院采集改良Hodge试验附

2、生样品24份。经细菌分

3、离、培养、API细菌鉴定系统，共分离剑肺炎克雷伯菌11株，人肠杆菌4株，弗劳地枸橼酸杆菌3株，阴沟肠杆菌5株，产酸克雷伯菌1株。首先，对这24株菌株进行常州抗菌药物的药敏试验。然后，在药敏试验的基础上，采JL}jPCR反应对这些菌株进行碳青霉烯酶基冈(blaKPc、blaGEs、blaIMP、blaVIM和6肠oxA-48)的检测，初步了解碳青霉烯酶基冈在这些I氢株中的流行情况，){：同时检测了碳青霉烯酶blaKPc基冈附

4、生菌株携带ESBLs基冈(blaTEM、blaSHV矛lJblacTx．M)以及AmpC酶基冈仍肠DHA-l雨16肠cMY

5、-2)的情况。为了进‘步了解碳青霉烯酶基冈blaKPc_2的传播方式及机制，首先对碳青霉烯酶基冈blaKPc_2Igll性菌株进行质粒抽提，采JL

6、jSouthern杂交证实碳青霉烯酶基冈blaKPc-2是否位丁．野生菌株的质粒上。接着利用电穿孔转化试验将野生菌质粒导入受体凿DHl0B中。将野生菌株和转化菌株的质粒进行MegaBase琼脂糖凝胶电泳，分析其耐约质粒图谱差异；并采川Southern杂交证实碳青霉烯酶blaK附2基冈是否转化成功；通过对电转菌株质粒进行酶切，将酶切片段与pBCSK+载体连接并转化、插入片段确认成功肝，送基冈测序公司进

7、行测序，并进行序列比对，以进一步了解blaKPC-2基冈的分子遗传环境。药敏试验显示，24株肠杆凶科细菌对10种常刚抗凶药物均早现多重耐约，且全部对氨曲南、头孢曲松、头孢他啶、头孢呋辛利多阳环素耐约，耐约率高达100％；对弧胺培南、美罗培南、环丙沙星、庆人霉素和多粘菌素的耐约率分别是75．0％，66．7％，87．5％，95．8％和20．8％。在24株肠杆菌科细菌中，碳青霉烯酶基冈blaKPc-2的检山率为87．5％(21／24)，其他碳青霉烯酶基冈(blaGEs、blalMP、blaVIM矛llblaoxA-48)的检山率均为0％，21株碳青霉

8、烯酶基冈blaKPc．2附

9、生菌株ESBLs基网blaTEM、blasH”blac，rx_M_l、blaclx-M-2、blacJX-M-9年llbla刚x．M8，，25的检出率分别为85．7％(18／21)、52．4％(11／21)、14．3％(3／21)、42．9％(9／21)、9．5％(2／21)利0％(0／21)，AmpC酶基因blaDHA-1乘lblacMY-2的检出率分别为23．8％(5／21)弄1133．3％(7／21)。转化试验，质粒图谱及质粒酶切图谱比较分析结果表明，携带blaKPc-2基冈的附I生质粒可传递给受体菌E．col

10、iDHl0B，肺炎克雷伯菌和弗劳地枸橼酸杆菌中基冈blaKPC-2所在的质粒人小相同。Southern杂交证实blaK附2基因位丁质粒上。成功地获得了1株长约3．2kb的blaKPC．2基因分子遗传I到谱，在3．2k的图谱中，blaKPC-2基冈的上游存在着lS劬门8插入序列，F游存在着IS幼n6一like的插入序列，同时在IS印"占插入序列和blaKPc．2基因之间存在一部分不完整的blaxEM序列。河南农业入学2012届硕士学位论文综上所述，2009年5月．2010年11月从河南省某医院分离鉴定的24株肠杆菌科细菌早现多重耐药。亚胺培南和美

11、罗培南的耐药率为75．0％和66．7％。碳青霉烯酶基冈blaKPC．2在河南省某医院的肠杆菌科中已普遍存在。质粒酶切图谱和Southern杂交证实源于同一病人的不同菌种拥有一个人小相同的blaKPC-2基因刚性质粒，并通过质粒介导发生耐药基因的转移。blaKPc．2基I天l的遗传环境研究显示，虽然blaKPc．2基冈所处的遗传位置存在很大的不同，但均与移动的遗传因子有关，推测blaKPC-2基因可能通过整合或转座的方式发生水平转移。关键词：肠杆菌科细菌；碳青霉烯酶：blaK附：：电转化；杂交2河南农业大学2012届硕士学位论文AbstractS

12、upervisor：AssociateProfessorDuXiang—dangMasterCandidate：ZhaoLeiCarbapenemas