芋病原病毒鉴定及其分子特性研究

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1、华中农业大学硕士学位论文芋病原病毒鉴定及其分子特性研究姓名：施世明申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：洪霓201206芋病原病毒鉴定及其分子特性研究摘要芋[Colocasiaesculenta(L．)Schott]是天南星科(Araceae)芋属(Colocasia)多年生宿根草本植物，作为粮食和蔬菜在世界各地广泛种植。病毒病害严重威胁芋的生产，本研究调查了中国芋病毒病的发生状况，采用PCR和RT-PCR的方法对我国芋病原病毒进行了鉴定，并分析了相关病毒的分子特性，旨在明确我国芋病原病毒的种类及危害情况，并为相

2、关病毒检测技术及芋病毒病防控体系的建立提供技术支持。所获研究结果如下。1．对湖北地区种植的芋进行了田间调查，田间芋病毒病发生普遍，症状表现主要有花叶、羽状斑驳、畸形皱缩和褪绿斑点等。2010年9月底的调查结果显示，武汉蔬菜科学研究所水生蔬菜资源圃保存的芋品种，表现以上四种症状的植株率分别为26．92％、16．67％、28．21％和3．85％。2．采用RT-PCR技术对采自中国湖北、浙江和山东3省的129份芋样品的芋花叶病毒(Dasheenmosaicvirus,DsMV)进行了检测，综合检出率为27．9％。其中武汉蔬菜

3、所提供的17份芋组培苗样品DsMV检出率最高，达58．8％，但均无明显病毒病症状；而来自湖北不同田间的99份样品的DsMV检出率为9．5％一42．9％，来自浙江金华田间的10份样品DsMV检出率为40．0％，来自山东临沂田间的3份样品未检测到该病毒，这112份田间样品均表现出明显的病毒病症状。对其中14个DsMV分离物的317bp扩增产物(为外壳蛋白基因的一部分)序列分析的结果显示，各分离物内的核苷酸变异相对较低，而分离物间存在较大的分子变异，相似性为68．3％．97．8％。对来自湖北的2个分离物DsMV-SCS和Ds

4、MV-ZP及浙江金华的1个分离物DsMV-JH的外壳蛋白基因(coatproteingene，CP)进行了测序，全长分别为951bp、942bp和987bp，3个分离物间CP基因核苷酸相似性分别为78．2％、79．0％和85．5％，氨基酸相似性分别为85．O％、82．3％和89．2％，与己报道的DsMV的CP基因的核苷酸相似性分别为73．0％．78．9％、73．9％．91．9％和74．3％．92．1％，氨基酸相似性分别为77．O％．86．5％、74．8％．97．1％和74．8％．98．2％，系统进化分析显示，各DsMV

5、分离物的系统进化关系与其寄主和地理来源无明显的相关性。3．采用己报道的杆状DNA病毒属通用引物BadnaFP／BadnaRP，对26份芋样品进行PCR检测，从13份样品中扩增得到大小约600bp的目标产物。序列分析结果显示，13份样品中有7份样品12个克隆含有杆状DNA病毒属病毒的保守序列，华中农业大学2012届硕士研究生学位论文序列长度均为576bp，而另外6份样品所得序列长度在600bp左右，大小不一，且并非杆状DNA病毒属病毒序列，说明此对引物并不适合作为该属病毒的检测引物。所得7个样品12个克隆的杆状DNA病毒

6、属病毒序列比对结果显示，其分离物内和分离物间核苷酸序列相似性分别为89．9％．100％和78．8％．99．5％，氨基酸序列相似性分别为94．8％．100％和81．8％．99．5％。该序列与NCBI上所登录的杆状DNA病毒属病毒表现出较高的同源性，但均低于80％，系统进化分析显示其为杆状DNA病毒属的病毒新种。根据所得的杆状DNA病毒属7个分离物12个克隆的序列设计用于此病毒检测的引物P197和P433，对51份芋样品进行了检测，从38个样品中扩增得到大小为257bp的目标产物，检出率为74．5％。4．在进一步克隆此病毒

7、基因组全长的过程中，用根据已得序列设计的正向引物P197和反向引物RPl408，从8个阳性样品中得到13个克隆的目标序列，各序列长度不一，在1724bp．1771bp之间，该序列各分离物内和分离物间核苷酸相似性分别为85．5％．98．9％和85．5％．99．6％。序列分析显示该序列5’端约600bp的序列为杆状DNA病毒属病毒RT和RnaseH基因保守序列，而3’端约1．1kb的序列则不是杆状DNA病毒属病毒序列，根据3’端约1．1kb序列设计的正向引物P1161和反向引物RPl408能从所有样品中(包括此杆状DNA病

8、毒检测为阳性和阴性的芋样品及一份黄瓜叶片样品)检测出目标条带，说明该序列为寄主植物基因组序列。对两个阳性样品的芋总核酸进行琼脂糖凝胶电泳后回收芋基因组条带，以此芋基因组回收产物作为模板用此病毒检测引物P197和P433进行PCR扩增，仍能得到目标病毒条带，说明该病毒序列已经整合到寄主植物芋的基因组中，而对该病毒基因组全长的克隆则未