g蛋白偶联受体对grk功能调控的研究

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1、复旦大学博士学位论文G蛋白偶联受体对GRK功能调控的研究姓名：李家立申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：马兰20030517复旦大学博士学位论文G蛋白偶联受体对GRK功能调控的研究蕴星围GPCR、G蛋白偶联受体GRK，G蛋白偶联受体激酶DOR，5-阿片受体wT_野生型5．阿片受体A31，羧基末端缺失的DOR突变体M3．T358A／T361A／S363GDOR突变体KOR，K-5可片受体MOR，p．-阿片受体HEK．人胚胎。肾细胞GFP,绿色荧光蛋白复旦大学博士学位论文G蛋白偶联受体对GRK功能

2、调控的研究中文摘要G蛋白偶联受体(GPCR)是一类重要的细胞表面受体。GPCR的细胞内信号主要由G蛋白介导。激动剂的持续存在能引起GPCR的失敏，而激动剂诱导的GPCR磷酸化和内吞等是GPCR介导信号的负调控的主要机制。G蛋白偶联受体激酶(GRK)是催化激动剂诱导的GPCR磷酸化以及启动GPCR脱敏的关键激酶。已发现七种GRK(GRKI-?)，其中GRK2和6RK3主要分布在细胞浆，GRK的功能受GPCR和G蛋白等多种因素的严格调控。已*flGRK2和GRK3只有与G蛋白脚亚单位结合后才能向细胞膜转位

3、，而且GRK只有与激活的GPCR结合以后，才能被激活并产生催化活性。现有的GRK功能调控假说认为：激动剂激活GPCR后导致游离的G所二聚体释放，随后GRK与锚定在细胞膜上的Gp丫亚单位结合使GRK转位至细胞膜并磷酸化GPCR。但这一假说尚未得到体内实验证实，GRK向细胞膜转位和催化受体磷酸化的具体机制也不清楚。本研究在人胚胎肾细胞系(HEK293)中以6一阿片受体(DOR)为模型探讨了GPCR对GRK功能的调控机制，主要研究了激动剂诱导的GRK与G蛋白偶联受体和GRK与GBy的相互作用及其对GRK细胞

4、膜转位；}EIGRK功能的影响。本研究结果表明：(1)激动剂激活野生型DOR能诱导GRK2和受体的结合，使6RK2由细胞浆转位至细胞膜并催化DOR发生磷酸化。而在表达DOR羧基末端缺失突变体△3L(不含有GRK磷酸化位点)的细胞中，激动剂的刺激不仅不能引起受体发生磷酸化，也不能诱导GRK2和受体的结合以及GRK2l_细胞膜转位。这一结果证明，DOR的羧基末端是决定GRK2与受体结合的关键区域，并提示GPCR与GRK的结合是激动剂诱导GRK向细胞膜转位的必要条件。(2)进一步的实验结果显示，将DOR羧基

5、末端GRK磷酸化位点邻近的酸性氨基酸突变为中性氨基酸(E355Q／D364N)后，激动剂刺激不能诱导其与6RK2的结合，并且也不能引起GRK21BJ细胞膜转位及使受体发生磷酸化。而所有三个GRK磷酸化位点都突变的DOR(M3)尽管不能发生磷酸化，但在激动剂刺激后能够与-GRK2结合，并雳导GRK2Ifi]细胞膜转位。这些结果证明DOR的GRK磷酸化位点在GRK2与受体结合中不起重要作用，而其邻近的酸性氨基酸残基是受体结合GRK的关键位点。(3)实验结果显示，在激动剂刺激后，受体免疫复合物中彳i仅含有G

6、RK，而且可检测出G0。G[37,_!J]E基在受体复合体中的存在取决于受体与GRK的相互作用。共表达GpY亚单位能促进激动剂诱导的GRK2和受体的结合以及6RK2向细胞膜转位。而共表达能够竞争结合G脚亚单位的Gc‘t或GRK2羧基末端能够完全抑制激动剂诱导的受体和GRK2彭J结合以及GRK2向细胞膜转位。这些结果证明激动荆刺激能诱导DOR—GRK2一G卧复合体形成，并且这种复合体的形成是激动剂诱导的GRK2向细胞膜转位及GRK发挥功能的一个关键环节。复旦大学博士学位论文G蛋白偶联受体对GRK功能调控

7、的研完上述研究结果表明，G蛋白偶联受体不仅仅是GRK的底物，而且还是调控GRK功能的一个重要的因素。激动剂诱导的GPCR与GRK的结合是GRK向细胞膜转位的必要条件之一：激动剂能够诱导GPCR、GRK、GBY在细胞膜上形成复合体，这种GPCR—GRK—Gc卧复合体的形成是GRK向细胞膜转位及发挥催化功能的必要条件。关键词：G蛋白偶联受体激酶，阿片受体，G所，膜转位，GPCR—GRK—GDY复合体，受体与GRK相互作用4复旦大学博士学位论文G蛋白偶联受体对GRK功能调控的研究AbstractGprote

8、in—coupledreceptorkinases(GRKs)catalyzeagonist—inducedreceptorphosphorylationOilthemembraneandinitiatereceptordesensitization．PreviousinvitrostudieshaveshownthatthebindingofGRKtomembrane—associatedG13Tsubunitsplaysanimportantrole