rna干扰对绵羊抑制素α亚基基因(inha)表达的抑制效果

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1、万方数据分类号：S墨13：3密级：公珏单位代码：学号：!QQ墨鱼2Ql13里5RNA干扰对绵羊抑制素仅亚基基因(INHA)表达的抑制效果RNAinterfe!renceinhibitionofsheepinhibinalphasubunitgeneexpression学位申请人：李婷指导教师：张英杰教授学科专业：动物遗传育种与繁殖学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一四年五月二十六日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论

2、文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北盛业大堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：硼p年厂月易夕日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑耋堡垒些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑兰垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文

3、在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期：叫卢岁月≯P日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：新签名：形签字日期：砂‘尸年，月冲日电话：邮编：万方数据基金项目资助IYlllllll2llllrt6llll16llll4(8IHl3lllll6lllll11lll国家现代肉羊产业技术体系建设项，编号：CAE$．39万方数据摘要抑制素(inhibin，INH)是由绵羊的卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞分泌的糖蛋白质激素，它是由一个0【亚基和一个D亚基通过二硫键构成的，其中抑制素Q亚基(INHA)是抑制素发挥生理功能必不可少的。抑制素能

4、抑制雌性动物促卵泡素(FSH)的释放，调节卵泡的生成；对雄性动物表现为抑制精子的发生，降低睾丸的生精能力。可见，可通过抑制抑制素Q亚基基因的表达，来降低动物体内的抑制素水平，从而促进卵泡发育和精子的生成，继而提高动物的繁殖力。RNA干扰技术是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默技术，具有高度的特异性。然而，根据以前的研究报告显示shRNA表达载体只能转录生成一种特异性的小干扰RNA，来阻断单一靶点的表达，干扰效率比较低。为了提高shRNA的干扰效率，我们在一个载体上插入两个靶点shRNA表达序列，即构建含有双启动子的sh

5、RNA表达载体，并将其与单个靶点shRNA载体的干扰效率作比较。本研究利用RNA干扰技术，根据绵羊INHA基因的cDNA序列设计构建shRNA重组质粒，通过双重PCR方法扩增启动子序列，构建含有U6和H1双启动子的不同靶特异干扰序列shRNA表达载体pGenesill．2-INHAl+2，单个靶特异性序列的单启动子表达载体pGenesill．2．INHA以及不针对任何序列的阴性对照重组质粒pGenesill．2-HK。用Iip2000将阴性对照、pGenesill．2．INHA、pGenesill．2-INHAI+2分别转染到绵羊的卵泡颗

6、粒细胞中，用荧光定量PCR的相对定量法来检测转染了48小时后，各样品瞬时转染后基因的表达量，计算干扰的效果。westernblot检测转染细胞INHA的蛋白表达情况。结果如下：1．酶切结果显示，试验成功的构建了双启动子shRNA表达载体pGenesill．2一INHAl+2和单启动子表达载体pGenesill．2．INHA。2．各重组质粒表达载体转染绵羊卵泡的颗粒细胞，瞬时转染48h荧光定量PCR检测结果显示，实验组与对照组相比，构建的shRNA表达载体pGenesill．2-INHA，pGenesill．2-INHAI+2对INHA基因

7、都有抑制作用，其中双启动子表达载体pGenesill．2-INHAI+2抑制效率较高，基因沉默达到83％。3．westernblot检测结果显示，在干扰作用下，细胞中蛋白的表达与空白对照组和阴性对照组相比明显减少，与对照组相比，实验组pGenesill．2-INHA，pGenesill．2-INHAI+2细胞中INHA荧光蛋白的表达量都有降低，而这两组相比，pGenesill．2．INHAI+2的荧光蛋白表达量降低更加明显。结论：综上所述，双启动子shRNA载体转染卵泡的颗粒细胞后，可显著降低INHA基因mRNA与蛋白的表达，相比单个靶特

8、异性序列的单启动子shRNA载体有更高的抑制效率。关键词：RNA干扰；shRNA；INHA；qPCR；Westernblot万方数据RNAinterferenceinhibitionofshe