第七章克隆基因的表达植物基因工程

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1、酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。第二节外源基因在真核细胞中的表达真核或病毒启动子MCSPolyA信号终止子外源基因一、选择标记基因和报告基因选择标记基因：是在选择压力下将转化体筛选出来，因此它实际上是一种未转化细胞的抑制剂，但它对转化细胞的生长和分化不影响。如:新霉素磷酸转移酶基因（Npt-II)、二氢叶酸还原酶基因（DHFR）报告基因：报告和识别作用，它的表达产物对植物无毒性，它反映外源基因在植物细胞中的转译水平。如：大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，（β-D-glucuronidase，GUS）；细菌和萤火虫的荧光素酶，luci

2、ferase）；水母绿色荧光蛋白（GFP）基因（GreenFluorescentProtein）。转基因植物的筛选与检测转入萤火虫的luciferase的烟草根据报告基因编码特点：1.抗性基因2.编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因或发光基因根据检测不同阶段区分：1.DNA检测法：检测外源DNA是否已经整合到植物基因组中2.RNA检测法：判断外源基因是否转录3.蛋白质检测法：判断外源基因是否翻译一、抗性的报告基因所需要的条件:1.抗性的基因应该是显性的2.在选择压力存在下,转化细胞能继续生长,而非转化细胞受到抑制,从而使转化子得以富积。

3、3.抗性基因的产物本身不能对转化细胞的生长或发育有抑制作用。4.选择物价廉易得,且非转化的靶细胞对其没有抗性或抗性极低。抗性基因:1.抗生素抗性基因:使抗生素失活,解除抗生素对转化细胞在转录和翻译过程中的抑制作用,使转化细胞得以继续生长。1)npt产生新霉素磷酸转移酶，对卡那霉素、巴龙霉素、新霉素都有抗性，其中，卡那霉素抗性基因（kanr）新霉素抗性基因（NPTII）是最常用的标记基因。2)aphIV潮霉素磷酸转移酶基因，潮霉素抗性标记基因在禾谷类作物上的选择效率高。3)spt链霉素磷酸转移酶基因，来源于转座子Tn5，适合于叶绿体转化。4)

4、cat氯霉素乙酰转移酶基因，编码产物使氯霉素丧失抗菌活性，cat基因转化植物细胞能够产生对氯霉素的抗性，5)aacc3和aacc4，庆大霉素-3-N-乙酰转移酶，对庆大霉素有抗性。6)Ble博来霉素抗性基因，来源于Tn5，对博来霉素有抗性。2.抗除草剂基因:基因产物能抵抗除草剂的杀灭作用，除草剂抗性基因在植物遗传转化中可同时用做选择标记和培育抗除草剂的作物。1）bar编码磷酸化乙酰转移酶（PAT）使磷化麦黄酮（PPT）（除草剂Basta的活性成分）的自由氨基乙酰化从而对PPT解毒。2）epsps草甘膦抗性标记基因，草甘膦抗性标记基因已用作显

5、性选择标记，转入植物后，其草甘膦抗性比田间杀死所有杂草的剂量高4倍。3）als绿黄隆抗性标记基因，绿黄隆是一种磺酰脲除草剂，抑制乙酰乳酸合成酶的活性。绿黄隆抗性标记基因在水稻上可代替潮霉素抗性基因，转化效率相似。显色或发光报告基因GUS酶活性检测：β-葡萄糖苷酶（GUS）是一个水解酶，能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计和组织化学法对GUS活性进行定量和定位分析，检测方法简单灵敏。荧光素酶活性检测：该方法简单快速有效，不伤害植物，检测灵敏度高，对于低水平表达的基因有较大的意义。绿色荧光蛋白检测：

6、绿色荧光蛋白（GFP）与荧光激活的细胞分拣器或流式细胞仪（FACS）联用，使转化细胞的一步性实时检出成为可能，转化细胞与野生型细胞之间存在较强的荧光差别，它们可以在分拣器中快速分离。二、分子生物学检测方法：1）酶联免疫吸附（ELISA）检测利用抗原与抗体反应的特异性，当两者结合时，通过结合在抗体上的酶作用于特定的底物后发生显色反应，借助于比色鉴定转基因植物。酶与底物反应的颜色与样品中的抗原的含量成正比，因此ELISA检测可以对样品进行定性和定量检测。2）PCR技术检测：根据PCR产物是否与外源基因片段相同可以判定是否含有外源基因，PCR-s

7、outhern杂交进一步验证，以排除假阳性。3）分子杂交：Southern杂交可以确定外源基因在植物中的组织结构，整合的位置及拷贝数，F1代外源基因的稳定性。Northern杂交：检测转基因在转录水平上的表达，更接近于性状表现，更有现实意义。Western杂交：检测目的基因在翻译水平上的表达结果，能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现。Western杂交灵敏度高，能达到标准的固定相放射免疫水平。转基因植物中外源基因的表达与调节1.高等植物基因表达调节相关因素（1）高等植物的表达类型：持续表达、持

8、续失活、组织特异性表达（2）叶绿体基因表达与调节研究发现，叶绿体基因与核基因协同表达，叶绿体的发生和功能的维系需要同细胞核甚至是同线粒体间保持者复杂的信号沟通，它们之间只有相互协