人类长寿基因sirt1表达调控机制的研究

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1、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：宙兰查型出日期：丝!互三：篓关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采

2、用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：蠢岵师签名：按山东丈学博士学位论文人类长寿基因sIRTl的表达调控机制研究专业：医学遗传学博士生：商林珊导师：龚瑶琴教授中文摘要阐释寿命调控机制，实现延缓衰老、延长寿命的目的一直以来是人们关注的焦点及自然科学研究的热点。沉默信息调节蛋白2(silencinginformationregulator2，Sir2)，因其自身独特的生物学性质和功能，提示其将机体能量代谢、氧化状况与基因表达调控相耦联的重要作用而成为调控寿命基因研究的热点。Sir2为染

3、色体的异源结构组分，是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0NAD3依赖性组蛋白去乙酰化酶。该家族成员基因结构高度保守。目前，对Sir2基因调控寿命的机制在酵母、线虫等低等动物中研究的比较深入，已发现在酵母细胞中，Sir2基因缺失会导致酵母寿命缩短而其高表达则可显著延长寿命；线虫Sirt2．1可感受机体营养摄取状态，通过Insulin(IGF．1)／PI．3K／Akt(PKB)／FOXOfamily同源通路实现对寿命的调控。作为进化过程中保守性很强的一个基因家族，针对Sir2基因在高等哺乳动物乃至人类寿命调控中的作用近年来引起了研究者的极大关注。大量的

4、研究成果证实Sir2在维持基因组的稳定性、DNA损伤修复、有丝分裂调控及抗凋亡等生命活动中发挥重要作用。近年来对于Sir2通过调控其下游作用元件发挥生理功能的研究比较广泛且深入，如人类SIRTl可通过使抑癌基因p53特异位点的赖氨酸残基发生去乙酰化作用从而负性调节其活性，但目前对调控SIRTl基因表达调控的机制研究却很少。经过了近70多年，限制能量摄取(CalorieRestriction，CR)能够延年益寿已在自细菌直至高等哺乳动物得以证实，对其作用的确切分子机制目前所知甚少。现有研究发现在酵母、线虫、果蝇乃至小鼠中Sir2直接参与和介导

5、了CR对寿命山东大学博士学位论文的调控过程。尽管CR延缓衰老、延长寿命的作用在动物模型中已得到有效验证，但要将此策略应用于人类必定存在很大困难。因此，利用能够模仿CR效应的生物制剂来实现对Sir2的激活作用，从而间接发挥类似CR的作用似乎更具现实意义。最近有报道发现白藜芦醇(resveratr01．Res)可激活Sir2从而稳定了rDNA重复序列，使酵母寿命延长70％，同时体外实验发现Res可提高SIRTI对p53的去乙酰化作用。Res延长寿命的作用在线虫和果蝇中也得到了证实，且没有伴有其他遗传学操作所带来的如不育、侏儒等负面症状，且研究结

6、果提示Res作用机制与CR相同。经验和动物实验已证实植物多酚具有预防衰老相关性疾病如癌症、神经退行性病变及心脑血管疾病发生等多重功效，但其作用的确切机制还是未知数。我们在前期的研究工作中发现天然植物提取物绞股蓝皂甙以浓度依赖性和时间依赖性方式明显拮抗谷氨酸诱导的氧化性神经毒性，证实天然植物提取物具有显著有效的抗衰老功能。鉴于Sit2在抗损伤、抗癌和寿命调控中的重要角色，以及营养与环境因素可通过调控Sir2的活性发挥各种生理学作用，从而使深入探讨和阐明Sir2的表达调控机制显得尤为重要。为此，本课题进行了以下几个方面的研究：第一部分CR和Re

7、s对人类SIRTI基因表达的影响在低等生物和体外实验中发现CR通过激活Sir2来发挥延长寿命的作用，而Res是Sirtuin激活复合物(Sirtuinactivatingcompounds，STACs)，我们本部分实验工作中分析了CR和Res对人类SIRTI基因转录的作用。我们选择了四种不同的人类细胞株，即HEK293，U20S，HeLa和HepG2细胞，通过在培养过程中撤出血清或添加Res，培养12h后收集细胞，采用RT-PCR以及实时定量RT-PCR的方法，分析人类SIRTl基因mRNA水平。结果发现：1．对数生长期的人类HEK293和

8、HeLa细胞经CR处理后，其SIRTl基因mRNA水平明显高于对照，其升高幅度接近3倍；2．在培养基中加入20ttMRes能显著增加人类HepG2细胞和HeLa细胞S刀RTl基因