dek在非小细胞肺癌中表达及功能的研究

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1、·中文论著摘要·DEK在非小细胞肺癌中的表达及功能研究刖菁DEK是一种原癌基因，定位在6p22．3染色体，在急性髓系白血病(AML)的一亚型中第一次被报道。研究发现在多种肿瘤如视网膜母细胞瘤、肝细胞癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤以及成年人急性白血病中，DEK蛋白均出现过表达。DEK能部分抑制细胞的分化和过早衰老，并与恶性细胞抗凋亡相关。这些研究提示DEK在肿瘤细胞中有多种功能，是一个重要癌基因。但是DEK在tH,细胞肺癌中的表达情况与临床病理因素的关系还不清楚，其对肺癌细胞的作用及其作用机制未见文献报道。我们检测非小细胞肺癌中DEK的表达情况

2、，分析了DEK表达与临床病理因素的关系，通过干扰肺癌细胞系A549，SPC中DEK的基因表达，探讨了DEK对非小细胞肺癌细胞增殖及凋亡影响。材料与方法1、组织来源112例原发性tH,细胞肺癌标本及38例相应正常肺组织标本来自中国医科大学附属第一医院病理科存档蜡块，患者术前均未接受放化疗。男性72例，女性40例，年龄36--76岁，平均年龄6l岁。按2004年WHO肺肿瘤组织学分类标准：鳞癌48例，腺癌64例；高分化41例，中分化47例，低分化24例，有淋巴结转移43例，无淋巴结转移69例。依据国际抗癌联盟(UICC)修订的肺癌TNM分期标准：l期55例，Il期

3、33例，III期24例。2、免疫组织化学染色免疫组化检测试剂盒和浓缩型DAB试剂盒为福建迈新生物工程有限公司产品，DEK多克隆抗体为ProteinTechGroup中国分公司．武汉三鹰生物技术有限公司产品。操作步骤简略为：将石蜡组织块切成49m厚的切片，脱蜡，脱水，在柠檬酸盐抗原修复液中修复后，按SP法操作步骤进行，一抗用抗DEK的多克隆抗体(1：200)40c孵育过夜，生物素标记的二抗370C孵育30分钟，DAB显色，苏木素染色。为证明DEK蛋白抗体免疫组化检测的特异性，实验中以鼠IgG代替一抗作为对照，结果阴性。同时，选择DEK蛋白阳性染色的切片，以PBS

4、代替一抗的染色结果为阴性作为可信的实验依据。3、免疫组化结果判定标准结果判定：以棕褐色颗粒位于细胞核内判定为DEK阳性染色结果。并根据Beesley分级法，按阳性细胞数的比例将染色结果分为4级。O级：阳性细胞数为0,--5％；1级：阳性细胞数为6‰25％：2级：阳性细胞数为26％～50％；3级：阳性细胞数为50％以上。同时，计算阳性率的方法设定为：(1)阳性率：指l级和l级以上的阳性染色病例百分数；(2)强阳性率：指2级和2级以上的阳性染色病倒百分数。4、细胞培养和siIⅢA干扰人肺腺癌A549细胞系用含有10％胎牛血清和100U／mL青链霉素的DMEM培养基

5、，肺癌细胞系SPC用含有10％胎牛血清和100U／mL青链霉素的1640培养基培养，均在37。C，5％C02条件的培养箱内培养。转染前24小时将细胞按50％密度接种于6孔板，采用DharmaFECT1转染试剂进行转染，转染48小时后使用PCR和Westernblot检测干扰效率。5、Rr．PCR对于培养的细胞或者剪碎的组织利用Trizol试剂(Invitrogen，USA)裂解，然后按照说明书的步骤，提取总的RNA。我们使用AMVVer3．0(Takara，Shiga，Japan)试剂盒。PCR产物通过2％的琼脂糖凝胶电泳，采用(ImageJ)Bio—Imag

6、ingSystem进行灰度值测定，以p-aetin作为内参。6、WesternBlot法检测蛋自表达收集细胞加入裂解液充分裂解，低温高速离心f4℃，15000转／min，15min)，提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60I．tg。电泳(10％SDS—PAGE凝胶)、转印(50V,90min)、5％正常小牛血清封闭，抗DEK(1：2000,proteinTech)和抗13-actin(1：500)，4"C孵育过夜，分别与对应的二抗(1：4000，santacruz，USA)室温孵育2h，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪(ChemiImager5500，Al

7、phaInnotech，USA)2采集，进行灰度值测定。7、MTT法检测细胞增殖及集落形成实验将单个细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔体积100ul含3．5x103个细胞，培养24hr，每孔加入MTr(3-【4，5-2一yl】-2，5一diphenyltetrazoliumbromide)溶液(5mg／ml，Sigma，USA)继续培养4hr，吸去上清液，加入150ulDMSO(Sigma，USA)，振荡10min，490nm波长下测定各孔光吸收值，以不含细胞的等体积培养基作对照。绘制细胞生长曲线。集落形成实验在干扰48小时后接种400个细胞于6em培养皿中2

8、周后用苏木素染色．8、数据分析采用SP