d-苯丙氨酸基因工程菌初步的构建

《d-苯丙氨酸基因工程菌初步的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、UniversityofScienceandTechnologyofChinaAdissertationforMaster’SdegreeThePreliminaryConstructionofGeneticEngineeringEIcoilProducingD—PhenyIalanineAutllor’sName：speciality：Supervisor：Finishedtime：TongtongTaoGeneticsProf．TingyiWenApirl，2012中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在

2、导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：签字日期：中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文

3、的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。口公开口保密(——年)作者签名：鹂捆揭签字日期：盘＆!厶：ff导师签名：签字日期：摘要D．苯丙氨酸是L．苯丙氨酸的手性对映体，与L．苯丙氨酸理化性质近似，仅旋光性相反，在医药、食品等领域具有广泛的应用价值，D-苯丙氨酸属于非蛋白型氨基酸，很难从天然产物中大量获得。其目前的主要生产方法为化学合成法，成本很高，无法满足D．苯丙氨酸逐渐升高的市场需求。因此，发展新的廉价的生产D．苯丙氨酸乃至D．氨基酸方法是目前国际上氨基酸领域的研究热点。直接发酵法是L．苯丙氨酸的主要生产方法，其效率高、低成本

4、、工艺流程简单。但目前国内外仍无法实现D．苯丙氨酸的直接发酵法生产，其最主要原因就是没有性能良好的的胁苯丙氨酸生产菌株。本文以野生型大肠杆菌W3110为出发菌株，以构建D．苯丙氨酸基因工程菌株为目标，对大肠杆菌L．苯丙氨酸合成与分解代谢进行系统的研究和改造，并且构建了其本身不存在的D．苯丙氨酸合成模块。通过无痕敲除等基因工程手段，初步构建了D．苯丙氨酸基因工程菌株。首先对大肠杆菌中存在的苯丙氨酸合成途径进行改造，通过敲除邻氨基苯甲酸合酶基因(trpE)、分支酸变位酶基因(OrA)，阻断合成色氨酸、酪氨酸的合成支路；解除关键酶分支酸变位酶

5、颀苯酸脱水酶基N(pheA)的反馈抑制，构建p矗洲押基因和另一限速酶DAHP合酶基因aroF的表达质粒，获得了基因工程菌株EC237。我们通过摇瓶发酵验证EC237具有积累L．苯丙氨酸的能力，同时也表明上述基因工程改造可以有效的扩大L-苯丙氨酸的合成通路的代谢流；在EC237的基础上，引入了来源于枯草芽胞杆菌W168的m氨基转移酶，构建了D．苯丙氨酸生物合成途径，通过敲除L．苯丙氨酸转氨酶基因(aspC,tyrB)使苯丙酮酸得到有效积累，通过敲除D．苯丙氨酸分解酶的基因(dada)阻断D．苯丙氨酸的分解，最终构建了D一苯丙氨酸的初级基因

6、工程菌EC238。经过48h的摇瓶发酵菌株EC238有2．35mmol／L的苯丙氨酸积累；在7．5L发酵罐上发酵48h，菌株有6mmol／L的苯丙氨酸积累，菌株的产酸能力与摇瓶发酵相比提高2．55倍，其中有0．5mmol／L的D．苯丙氨酸。通过发酵实验我们证明了菌株EC238有可能具有合成D．苯丙氨酸的能力。m苯丙氨酸初级基因工程菌株的构建为高产菌株的构建奠定了基础，本课题的研究也将为利用葡萄糖发酵生产其他阻氨基酸及衍生物的工业微生物遗传育种提供理论基础和实践经验。关键词：大肠杆菌D．苯丙氨酸发酵基因工程改造ABSTRACTD—phen

7、ylalanineisthechiralenantiomerofL-phenylalanine．Theenantiomershavethesimilarphysicochemicalpropertiesexcepttheoppositepoticalactivity．D-phenylalanineiswidelyappliedinthefieldofmedicine，food，etc．D-Phenylalanine，akindofnonproteinaminoacids，cannotbelargelymadefromnaturalpro

8、ducts．D—phenylalanineismainlysynthesizedbychemicalmethodatpresent,whichcannotmeetthegrowingneedsofD-phe