微生物(酵母)的培养基优化

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1、实验一微生物(酵母)的培养基优化(指导教师:汪文俊熊海容王海英肖新才实验员:张继泰)一．实验目的：掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。二．实验原理生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。三．仪器与试剂全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。试剂为葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、KH2PO4。四．实验方法(1)、培养基的配制(见表1,2)表1正交表试验设计因

2、素水平葡萄糖蔗糖酵母膏KH2PO411.00.00.50.522.01.01.01.033.02.02.02.0表2正交表实验方案葡蔗酵KH2PO4生物量（OD）编号萄糖糖母膏（D）0h12h24h36h48h60h(A)(B)(C)1(1)(1)(1)(1)2(1)(2)(2)(2)3(1)(3)(3)(3)4(2)(1)(2)(3)5(2)(2)(3)(1)6(2)(3)(1)(2)7(3)(1)(3)(2)8(3)(2)(1)(3)9(3)(3)(2)(1)（2）将上述培养基配制好以后，每250ml三角

3、瓶装入培养基100ml，于121℃下灭菌30min，冷却。（3）冷却后接种（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养。1（4）测OD值：将接种0h、12h、24h、36h、48h、60h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。五．思考题(1)比浊计数在生产实践中有何应用价值?(2)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何

4、选择波长?实验二紫外线的诱变育种(指导教师:汪文俊熊海容王海英肖新才实验员:张继泰)一．目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。二．基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。三．菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机四．操作步骤（1）菌悬液的制备（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5

5、支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。（3）紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。（b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁

6、力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。(4)稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。2(5)涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。(6)培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。(7)计数将培养4

7、8小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。(8)观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。五．实验结果1．结果将实验结果填入下表。稀释倍数平均菌落处理时间（数/皿）10-410-510-6存活率%

8、致死率%诱变剂（min）0（对照）紫外线1（UV）3透明圈和菌落直径大小（㎜）及其HC比值结123456果透菌HC透菌HC透菌HC透菌HC透菌HC透菌HC明比明比明比明比明比明比圈落值圈落值圈落值圈落值圈落值圈落值处理3UV处理对照六．思考题(1)用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？(2)经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？实验三玉米淀粉液化及糖化(指导教师:汪文俊熊海