人血栓调节蛋白转基因克隆猪的制备及表达鉴定

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1、ProductionofclonedpigsexpressinghumanThrombomodulininendothelialceUsandit’sidentificatiOnofexpression．ADisseIrtationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniVers时iIlPartialFul舢mentoftheRequirementsfortheDe铲eeofMasterofScienceBySupervisor：Prof．XiIlghuaTianDate：Ma

2、y，2014关于学位论文独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外．论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人郑重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为，文责自负。学位申请人(学位论文作者)签名：．王．望丝关于

3、学位论文著作权使用授权书201q年奶f]日本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者，本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文(纸质文本和电子文本)以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手段保存、汇编学位论文(纸质文本和电子文本)。(涉及保密内容的学住论文在解密后适用本授权书)学位获得者(学位论文作者)签名：量丝礁学位论文指导

4、教师签名：201归蛔悟摘要随着同种器官移植在临床上的迅速发展，使器官需求量同益增加，伴随而来的同种异体器官的供应短缺也日益严重。异种移植是解决这一问题的潜在途径之一。猪凭借其解剖学和生理学上与灵长类高度相似的特点，被作为应用于器官移植的一种理想供体动物。近年来0【一l，3．半乳糖转移酶基因(旺一1，3-galactosylt啪sferase-hockout，GT-KO)敲除猪、表达人补体调节蛋白转基因猪的出现使得超急性免疫排斥反应不再是最主要的问题，异种移植后的凝血障碍更亟待解决。血栓调节蛋白(Tkombomod

5、ulin，TM)是存在于血管内皮细胞表面的一种具有很强抗凝活性的糖蛋白，可与凝血酶结合参与蛋白c途径调节凝血，在克服凝血紊乱的研究中起关键作用。本研究采用猪内源TM启动子调控hTM构建表达载体，通过核移植及胚胎移植技术成功制备了血管内皮特异性表达hTM的转基因克隆五指山小型猪，结果如下：研究一：本研究首先以大白猪TM基因座BAc为模板，通过PCR技术构建抓捕载体PBR322．catch，经序列测定，同源性为100％。再利用Red同源重组系统介导的“gap-r印a矿’基因抓捕技术，从含大白猪TM基因座的BAc(细菌

6、人工染色体)上亚克隆7kb的TM启动子，经酶切鉴定，大小与预期一致。研究二：通过PcR技术获得表达载体所需各元件的亚克隆片段，经T-A克隆，酶切、回收、酶连至克隆载体pBlueScriptII(SK一)中，再将获得的完全同源的TM启动子连入表达载体中，构建完成含有嘌呤抗性(Puromycjn，Pllro)的血管内皮细胞特异性的表达载体pBs-hTM。研究三：将构建完成的抓捕载体经xh01I线性化后，通过电击转染胎儿成纤维细胞系wPFl76和wPFl69，用含有1．0¨g／mL嘌呤霉素筛选培养液进行约lO～15天的

7、筛选，共获得克隆点354个，经过PCR鉴定含有15个阴性细胞克隆点。研究四：以其中2个生长状态较好的hTM阳性细胞克隆做为供体细胞进行核移植，重构胚经融合激活后进行体外培养，其体外发育能力与普通重构胚无显著差异(P>0．05)。先后将972个重构胚移植到5头受体母猪体内，30天后B超检测怀孕2头，妊娠120天后共生产仔猪5头，其中1头死亡，其余4头生长状况良好，无畸形及其他异常状况。研究五：经新生仔猪耳组织基因组PCR鉴定，组织ImPcR以及westemblot鉴定，15头仔猪中1头为阴性，其余4头均为阳性，且严

8、格遵循血管内皮细胞的特异性表达。综上所述，本研究成功获得血管内皮特异性表达hTM基因的转基因克隆五指山小型猪，异种移植后的凝血紊乱问题有望解决，且显著延长术后的存活时间。为多基因修饰猪的制备奠定的实践基础，进一步推动异种移植在临床研究方面的发展。关键词：异种移植，血栓调节蛋白，血管内皮，特异性表达，五指山小型猪IlABSTRACTWi仇therapidlydeVelopi