免疫共沉淀原理及实验方法

《免疫共沉淀原理及实验方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、数据加载中...注册┆登录┆发表文章·  免疫共沉淀原理及实验方法  2007-03-2216:07:46大中小免疫共沉淀一原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次，要注意溶解

2、抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，

3、确定好比例很必要。(待续)二准备：器械#微量高速冷冻离心机#移液枪#旋转盘#电泳设备#vortex震荡器#液氮及组织粉碎器#eppentube试剂#细胞或组织#蛋白定量kit#SDS电泳试剂#抗体(单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig兔血清)#PBS#NaN3#proteinAsapharose试剂配制抗原蛋白溶解缓冲液1.RIPA缓冲液(最终浓度)1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)5MNacl15ml(150mM)0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)20%TritonX-10025ml(1%)10%DOC50ml(1%)10%SDS5ml(o.1%

4、)TLCK18.5mg(0.1mM)TPCK35mg(0.2mM)DDW395mltoal500ml另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水)2.NP40lysis缓冲液1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)5MNacl15ml(150mM)0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)20%NP4025ml(1%)TLCK18.5mg(0.1mM)TPCK35mg(0.2mM)DDW450mltoal500ml使用前加1mM的PMSF注意点：*Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。*

5、反复使用PMSF要注意保管方法。*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC

6、清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存用单抗做一抗时，把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。避免长期保存。2．抗原的检出以下操作全在冰面或4度进行去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量：6cm的培养皿加1ml

7、(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。30m，15000rpm离心，上清转移到新tube。不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h加proteinAsapharose50ul，再混匀1h5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex混匀，离心，去上清。重复4次洗净。加电泳用sample缓冲液