（果树学专业论文）柑橘cbf类似基因的克隆与分析

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1、华中农业人学硕十学位论文柑橘CBF类似基因的克隆与分析摘要柑橘是亚热带水果，在栽培范围上受到低温的限制。周期性冻害往往导致柑橘果实产量降低、品质下降，甚至树体死亡，从而造成巨大的经济损失。因此，防治冻害就成为柑橘产业发展和提高其经济效益的一个重要问题。解决这一问题的主要方法途径是加强Ffl问管理和选育抗寒新品种，而后者是根本途径。近年来，采用基因工程手段培育新品种已成为农作物育种的一种趋势。植物抗寒性属于复杂的数量性状，是多基因协同作用的结果。采用单一基因转化植物，虽能在一定程度上提高转基因植物对低温的抗

2、性，但实际效果往往不理想。CBF是调控一系列植物冷驯化相关基因表达的一种转录因子，在低温诱导下迅速合成，与相应顺式作用元件CRT／DRE结合，促进基因的转录，进而合成糖类、脯氨酸和膜蛋白等物质，提高植物的抗寒性。基因转化试验证明，CBF基因在拟南芥和油菜等多种植物中超量表达，转基因植株对低温的耐性均显著增强。这一发现为利用基因工程手段提高植物耐寒性提供了一条新途径。本研究从抗冻性明显不同的枳壳、脐橙和柠檬中分离出CBF同源基因的AP2核心区段，初步确证了柑橘中同样存在CBF介导的冷驯化过程。进一步从枳壳这

3、一抗寒性最强的柑橘种类中克隆出CBF基因的全长cDNA，并进行全面的生物信息学分析，为今后利用这些基因提高柑橘抗寒性奠定基础。主要的试验结果如下：1．探索柑橘叶片总RNA提取方法，先后尝试了异硫氰酸胍法、Trizol试剂法和热酚法，最终确定采用热酚法，并用LiCl沉淀的方法从柑橘叶片中提取的RNA最完整，DNA、蛋白质和多糖等杂质含量最少。2．参考拟南芥等其它物种中CBF蛋白的保守区域设计了四条简并引物，并筛选出最优的一对引物，用于RT．PCR扩增。结果从枳壳、脐橙和柠檬中各分离出一个CBF同源基因AP2

4、核心区段(柑橘CBFa基因)。并从枳壳中分离出另一个不同的CBF基因AP2核心区段(枳壳CBFl基因)。利用BLAST比对分析发现，这四个CBF片段与其它物种CBF蛋白间具有很高的同源性。脐橙和柠檬CBFa基因AP2区段的序列完全一样，而与枳壳CBFa基因AP2区段存在数个核苷酸位点的差异和一个氨基酸残基的差异。3．依据所分离的两个枳壳CBF基因AP2区段的核苷酸序列，设计分别指向5’和3’端的嵌套特异引物，参考SMARTRACE技术，采用巢式PCR分别扩增枳壳CBFa和CBFl基因的5’和3’端。测序验

5、证后，在5'-UTR和3'-UTR区设计引物，PCR扩增获得全长基因，或者采用酶切拼接法获得全长基因。结果成功获得了枳壳CBFa和CBFl基囚的全长cDNA。柑橘CBF类似桀I矧的克隆‘j分析4．利用GeneBank、ExPASy、EMBOSS和Jalview等数据库和软件对所克隆的两个枳壳CBF基因全长cDNA进行全面的生物信息学分析，结果发现枳壳CBFa和CBFl基因都具有CBF特征序列、核定位信号序列、保守的AP2DNA结合结构域和潜在的酸性结构域。这是所有物种CBF因子的典型结构特征。此外，它们还

6、具有一些其它的特征位点，包括酰基化、酪胺酸硫化和Amidation位点以及一些蛋白激酶磷酸化位点，如蛋白激酶C磷酸化位点和酪蛋白激酶II磷酸化位点等。推测这些特征位点可能与翻译后加工、活性调节和正常功能的行使有关。关键词：柑橘；冷驯化；CBF；全长cDNA；基因克隆；生物信息学2华中农业人学硕．1：学位论文CloningandAnalysisofCBF--likeGenesfromCitrusAbstractAsasubtropicalfruit，citrusisrestrainedbylowtemper

7、atureonitsculturalarea．Naturalrecurrentlowtemperatureofteninducesdecreaseoffruitproductivity，declineoffruitquality，andevencausesdeathoftree，allofwhichmaydecreaseeconomicandecologicalprofitgreatly．So，avoidingorprotectingcitrusfromlow-temperaturedamageisani

8、mportantproblemonenlargingtheculturalareaandincreasingtheprofitofcitrusproduction．Mainmeasuresonsolvingthisproblemareimprovingfieldmanagement，selectingorcultivatingnovelvarietieswithhightolerancetolowtemperature．Atp