sybr green实时pcr检测恶性疟原虫与间日疟原虫方法的建立

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1、万方数据中图分类号UDCR382．361O硕士学位论文学校代码幽密级公珏SYBRGreen实时PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫方法的建立SYBRGreenRealTimePCRassayforRapidDetectionofPlasmodiumfalciparumandPlj仅．smodiumvivax作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期笙生：点：型李欢临床医学临床检验诊断学医学检验系王晓春教授答辩委员会主席—阻＼o中南大学2014年5月万方数据学位论文原创性声明1啪帅m砌帅㈣舢m帅Y2686490本人郑重声明，所呈交的学位

2、论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：2夔逸日期：卫生年』月爿日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可

3、以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：么妲是∑一目期：盟年』月型日导师签日期：日万方数据SYBRGreen实时PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫方法的建立摘要目的：建立一种检测恶性疟原虫和间日疟原虫的SYBRGreen实时PCR法，并将建立的方法进行初步临床应用。方法：1．针对恶性疟原虫与间日疟原虫18SrRNA基因设计2对(3条)外引物和2对(3条)内引物，建立可同时扩增出恶性疟原虫和间日疟原虫特异性片段的多重巢式PCR方法，并进行敏感性、特异性评价和临

4、床标本检测。2．利用上述巢式引物进行SYBRGreen实时PCR反应，同时进行熔解曲线和Tm值分析。优化实时PCR的反应体系与反应条件，检测该方法的敏感性、特异性和重复性并进行临床标本检测。结果：1．多重巢式PCR可同时扩增出恶性疟原虫和间日疟原虫的18SrRNA基因片段长度分别为162bp(恶性疟原虫)，112bp(1'N日疟原虫)，并能检出混合感染，该实验检测间日疟原虫的灵敏度为101copies／gl。特异性实验结果显示每对引物只检测对应的虫种，54份临床标本的检测结果与镜检法无差别(P>O．05)，敏感度为97．30％，特异度为5．88％。2．SY

5、BRGreen实时PCR构建的荧光定量标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系，扩增效率为101．884％，检测灵敏度为101copies／gl，从提取DNA到完成检测只需3小时，重复性好。该方法与三日疟原虫及卵形疟原虫无交叉反应，对临床标本的检测结果与多重巢式PCR检测结果一致。结论：1．本研究建立的多重巢式PCR方法可同时检测恶性疟原虫与间曰疟原虫，敏感性高，特异性强，可用于基层部门对疟疾的检TT万方数据测与恶性疟原虫和间日疟原虫的鉴别。2．本研究建立的SYBRGreen实时PCR方法具有污染风险低、灵敏度高、不需荧光标记探针、成本低及高通量等优点

6、，适用于疟疾的检测与恶性疟原虫和间日疟原虫的鉴别。图1l幅，表7个，参考文献53篇。关键词：恶性疟原虫；间日疟原虫；多重巢式PCR；实时PCR；检测方法分类号：R382．3III万方数据SYBRGreenRealTimePCRassayforRapidDetectionofPlasmodiumfalciparumandPlasmodiumvivaxAbstractObjective：TodevelopaGreenreal—timePCRassaytorapidlydetectPlasmodiumfalciparumandPlasmodiumvivax．An

7、dtousetheestablishedmethodsforpreliminaryclinicalapplication．Method：1．Twopairs(Threestrips)ofouterprimersandTwopairs(Threestrips)ofinnerprimersweredesignedaccordingtothesequencesofthe18SrRNAofthetwokindsofPlasmodium．Amultiplex-nestedPCRfordetectingPlasmodiumfalciparumandPlasmodium

8、vivaxwasestablished．Specificityan