荧光法研究秋水仙碱和牛血清白蛋白的相互结合作用

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1、第;"卷分析化学（5RISTHC)SCR）!研究简报第&期!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"%%$年&月G@A<:8:U3V7

2、能量转移机理，求算了给体（’()）与受体（秋水仙碱）间距离",;-#;<2和能量转移效率#,%-*=。实验表明：秋水仙碱与牛血清白蛋白的相互结合作用为单一的荧光静态猝灭过程。关键词!秋水仙碱，牛血清白蛋白，荧光猝灭，结合反应!"引""言秋水仙碱（?34?@A?A<:）是从欧洲的百合科植物秋水仙（$%&’()’*+,*-*+.,&/01）的球茎中分离而得到的一种卓酚酮类生物碱，也可从多种植物中提取。秋水仙碱可用于治疗痛风，对某些恶性肿瘤亦有较［*］好的疗效。近年来随着人们对其了解的不断深入，秋水仙碱在预防与

3、治疗家族性地中海热、肾脏淀［"］粉样变、某些皮肤病及纤维化性疾病等方面均显示较好的应用前景。据报道秋水仙碱可与血浆蛋白结合而有高的生物利用率，并且可以通过与微管蛋白的结合起到抑制细胞的增殖、分化、运动和物质运［;］输等作用。［$］白蛋白是主要的血清蛋白，可与许多内源、外源性化合物结合。本实验应用分子荧光法研究了牛血清白蛋白（’()）与秋水仙碱的结合反应，计算了其平衡常数及结合点位，并根据能量转移机制计算了秋水仙碱与’()结合时的作用距离。对探讨秋水仙碱的药物作用机理提供了可资参考的实验数据与理论根据。#"

4、实验部分#-!"仪器和试剂B&%型荧光光度计和C>;$%%型CD>DA8分光光度计（均为日本日立公司产品）；高纯水制备仪（日本EA44AF37:公司）。K;秋水仙碱（G*"H"&IJ#，;..-&，上海化学试剂供应站），配制成*/*%23410储备液；牛血清白蛋白（’()，北京军区兽医防治中心生物工程研究室，纯度L.BM，分子量#B%%%），加高纯水配制成*N10储备溶液，置于*O$P冰箱中保存。#-#"实验方法K$移取*N10的牛血清白蛋白%-"20于*%20具塞比色管中，依次加入一定量的*/*%234

5、10的秋水仙碱，以高纯水定容至刻度，在荧光光度计上以*?2石英比色皿测定荧光强度，测定光谱通带为K$&<2，激发波长!:Q为""=<2，发射波长!:2为;$%<2。移取*-%/*%23410的秋水仙碱%-#20于*%20比色管中，以高纯水定容至刻度，在CD>DA8分光光度计上进行吸光度测定。$"结果与讨论$-!"秋水仙碱与’()的相互结合反应及荧光猝灭作用机理蛋白质中由于色氨酸、酪氨酸的存在使其具有内源荧光（牛血清白蛋白!:Q1!:2,""=<21;$%<2），随着秋水仙碱浓度的增加，白蛋白的内源荧光强度

6、有规律地降低，激发峰与发射峰的峰位与峰形略有改"%%;>%#>*$收稿；"%%;>*">"#接受G"!G!分析化学第@>卷变，最大发射峰波长从@AB/7位移到@@>/7。如图"所示。据图"实验数据，计算了89:的荧光强度"B#"随猝灭剂秋水仙碱浓度的变化即9,)1/KL-.7)1曲线：A"B#"=M$BHHC"B!NB$H?J?，%=B&MHG@。随着秋水仙碱浓度的增加，"B#"逐渐增大，且二者呈良好线性A关系，直线斜率即荧光猝灭速率常数&=M&BHHC"BE<7-.。通常生物大分子的最大动态猝灭过程的速

7、［J］率常数&O"BBE<7-.。而实验所得猝灭过程的速率常数较动态猝灭过程速率常数大@个数量级，所!图"!秋水仙碱对牛血清白蛋白的荧光猝灭作用以猝灭不是由于秋水仙碱对89:动态碰撞引起的动#$%&"!’())**)+,-*+-.+($+$/)-/*.0-1)2+)/+)23)+,14-*态猝灭，而是由于秋水仙碱与89:形成了络合物引5-6$/)2)1074.507$/（89:）起的静态猝灭。从图"得知，秋水仙碱与89:的结D?!);>?/7<@AB/7；!89:=@C"B7-.

8、+(+$/)合作用较强，影响了蛋白质的二级结构，使89:的荧*1-7",-""：B、B&>、B&A、B&G、B&H、"&B、"&>、"&A、"&G、"&H4/I光峰加入秋水仙碱后向短波方向移动了H/7。这也>&B（C"BDJ7-.