2例结节性硬化症的基因突变研究

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1、安徽医科大学硕士学位论文酸，0．001mol／LEDTA13)6×加样缓冲液：0．25％溴酚蓝，40％(w／v)蔗糖水溶液·14)琼脂糖(美国Promega公司)15)溴化乙啶，10mg／ml贮存液(上海生工生物工程公司)。16)pUCl9DNA／MsplMarker(船I公司)2．2．4PCR产物纯化和测序试剂1)：rscl和TSC2基因外显子的引物各一套(上海生工生物工程公司合成)●2)外切酶I(ExonI)20U／pl(BIOLAB公司)3)虾碱性磷酸酶(shrimpacidphosphatase，SAP)1U／ul(USB公司)

2、，4)四种标有不同荧光标记的ddNTP5)醋酸钠(NaAC)(3M，PH-4．6)(上海生工生物工程公司)6)EDTA(上海生工生物工程公司)7)糖原(上海生工生物工程公司)．8)AmpliTaqDNA聚合酶，dNTP，MgCl：，10XBuffer(上海生工生物工程公司)。2．3实验器材2．3．1临床资料获取、组织病理检查重要器材1)80℃恒温箱、自动脱水机、漂片烘干机。2)LEICACMll00型超薄切片机(德国徕卡仪器有限公司)3)OLYMPUSBX一60多功能电光源显微镜(日本奥林巴斯公司)2．3．2DNA提取器材1)MSI微型

3、振荡器(马来西亚)2)Microtec1542R低温高速离心机(日本)3)BS60型电热恒温水浴箱(北京市医疗设备厂)4)全波长紫#I-／可见光扫描分光光度计ND一1000(NanoDrop公司)5)超低温冰箱(一85℃)(日本三洋公司)6)-20。C冰柜(中国海尔集团公司产品)7)美菱BCD-238型冰箱(中国美菱集团公司产品)9安徽医科大学硕士学位论文8)0．5～10ul、20～200ul、100～1000ulTip．(QualityScientific·Plastic，USA)9)0．1．～2．5ul、0．5，--50ul、50～

4、200l

5、1、200，--1000ul移液器(Eppendorf，German)10)1．5ml离心管(QSP产品)11)EDTAK3(或EDTANa4)抗凝真空管12)50ml试管架13)水浴锅14)摇床(TY-80R，国产)15)一次性塑胶手套2．3．3PCR反应、产物纯化、电泳、测序仪器1)MSI微型振荡器(马来西亚)．2)Microtec1542R低温高速离心机(日本)3)温度梯度PCR仪(德国)4)DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)5)Tanon-3500全自动数码凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)6)FD201稳压稳流

6、电泳仪(北京通用分析仪器厂)7)TN-100B型托盘式扭力天平(上海第二天平仪器厂8)H宣ier-20℃冰柜(中国海尔集团公司产品)9)超纯水仪(1005a，摩尔)i0)0．1～2．5ul、0．5～50pl、50～200ul、200～i000ul移液器(Eppendorf，German)11)0．5～lOul、20～200ul、。100～1000ulTip(QualityScientificPlastic，USA)12)200ulPCR薄壁管(Axygen)13)0．5ml离心管(QSP产品)14)1．5ml离心管(QSP产品)lO安徽

7、医科大学硕士学位论文15)CEQ8800测序仪(BEC融Ⅲ公司)2．4分析软件1)引物设计软件Primer(version5．O)2)序列读取软件Chromas(version2．31)3)美国国立生物技术信息中心：http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov4)网上在线孟德尔遗传：http：／／WWW．ncbi．nlm．nih．gov／Omim／5、Genebank：http：?f棚．ncbi．nlm．nih．gov／Genebank6、HumanBlatSearch：http：7f嘲、蕊．genome．UCSC．edu／c

8、gi—bin／hgBlat7)人类基因突变数据库：http：／／wwW．hgmd．cf．ac．uk／ac／index．php2．5实验方法和步骤2．5．1皮肤标本组织病理切片的制备局麻下切取患者皮损部位皮肤，然后放置于10％甲醛溶液中，再由科室病理专业技师按以下流程对切取的皮肤标本进行进一步处理：固定一水洗一硬化_÷脱水_透明一包埋一切片_÷染色。2．5．2全血标本采集获得知情同意后，抽取患者及正常成员和100位正常人静脉血5ml置EDTAK。(或EDTANa。)抗凝管中。然后置于一85℃超低温冰箱保存。2．5．3．基因组DNA的提取·

9、采用改良盐析法提取外周静脉血中的基因组。DNA，步骤如下：1)红细胞裂解：①吸取500u1全血置于1．5ml离心管中，加入800pl红细胞裂解液，翻转上下颠倒、混匀lO分钟。②室温下以3，000rpm转速离