家蚕质多角体病毒rdrp的基因克隆、表达及定位研究

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1、中山大学博士学位论文家蚕质多角体病毒RDRP的基因克隆、表达及定位研究姓名：孙京臣申请学位级别：博士专业：生物物理学指导教师：张景强20040510孙京臣家蚕质多角体病毒RDRP的基因克隆、表达及定位研究专业：生物物理学姓名：孙京臣导师：张景强教授摘要RNA依赖的RNA聚合酶(RNA．dependentRNApolymerase，RDRP)是RNA病毒增殖复制的重要酶类，具有转录酶和聚合酶的双重活性，即一方面参与mRNA的转录，指导合成病毒增殖复制所需要的蛋白质和酶类；另一方面参与以病毒RNA为模版的子代病毒基因的复制。家蚕质多角体病毒(BombyxmoriCytoplasmicPolyhed

2、rosisVirus，BmCPV)是呼肠孤病毒科，质多角体病毒属的代表种，为双链RNA病毒。已有的BmCPV冷冻电镜三维重构的研究结果表明，在病毒衣壳五重轴的内表面各有一花形结构，位于B-突起(B—spike)的近内侧，推测为转录酶复合物(TEC)，可能是BmCPV结构蛋白VP2的对应成分。应用RT—PCR和分子克隆等技术成功地从BmCPV中国株的dsRNA中分三段克隆了RDRP基因，大小分别为1442bp，827bp，1675bp，进行基因全序列的拼接后，获得了全长完整的BmCPV(C)RDRP基因(GenBank序列号为：AY496445)，该基因全长3691bp，GC含量为41．99％，

3、读码框为1-3678bp，共编码1225个氨基酸(GenBank序列号为：AAR88092)。应用VectorNT和DNAtools等软件对其氨基酸序列一级结构进行预测和分析，其等电点为7．67，属弱碱性蛋白，推导分子量为138648．25Da，含有6个ASN糖基化位点，6个CAMP依赖磷酸化位点，7个TYR蛋白激酶磷酸化位点，4个Tyrosinesulfationsite。二级结构分析含有43．59％的a螺旋，13．55％的B折叠，其余为42．86％的无规则卷曲。在线Blast分析表明，与BmCPV一1，DpCPV一1，LdCPV—l，LdCPV～14，TnCPV一15核苷酸同源性分别为89

4、％，81％，81％，54．1％和50．9％，氨基酸同中山入学博士学位论文源性分别为96．5％，93．1％，92．9％，41．1％和33．5％。根据核替酸同源性和氨基酸同源性分别构建了进化树，二者具有较好的一致性。应用Clustalx软件分析，定位了CPV—RDRP的3个保守区域(酸性区，核菅酸结合的核心区和催化功能核心区)。并在质多角体病毒RDRP的氨基酸序列的N端发现了其它比较保守的区域，推测这些保守区域对RDRP转录／复制酶特定的功能比较重要。对BmCPV—RDRP基因序列年NpET-28b载体的限制性内切酶位点进行分析，设计合成三对表达引物，应用RT-PCR等技术利用pET-28b载体，

5、成功构建了表达质粒pET28b—RDRP，并用IPTG(1mmol／L)诱导的方法，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了带有6×His的融合蛋白，蛋白质分子量为138kDa。Westernblot分析表明，表达的融合蛋白即为重组目的蛋白。以该重组蛋白为抗原制备了兔抗血清，并进行了Westernblot检测，制备的抗体能特异性地识另tJRDRP重组蛋白，而且与BmCPV(C)病毒粒子的总蛋白在138kDa处也有特异性免疫条带。结果表明所制备的抗体可以用于该重组蛋白的进一步研究。应用重组蛋白制备的兔抗为一抗，15nm山羊抗兔IgG一胶体金为二抗，阻BmCPV感染三龄起蚕的中肠后部，用3％多聚甲醛一

6、0．1％戊二醛混和液固定，应用K。M低温包埋、紫外光聚合等免疫电镜技术制各的超薄切片为抗原片，用1：200一抗和1：40二抗进行免疫标记，电镜定位，结果显示在病蚕中肠的柱状细胞的病毒发生基质中的游离病毒粒子和多角体内的病毒粒子上均能结合胶体金颗粒，标记率为15％左右，而且组织结构清晰。该结果证明BmCPV病毒粒子的TEC复合物确实位于病毒衣壳上，而且含量不高，这与BmCPV冷冻电镜三维重构的推断(Zhangetal，1999)相一致。应用分子生物学方法和免疫电镜技术，通过对BmCPV(C)RDRP的基因克隆、表达及定位研究，使对BmCPV冷冻电镜三维重构方面的研究成果与分子生物学方面的研究结果

7、有机地结合，从而为寻找RDRP的活性中心，研究病毒在体内的复制机制、酶的功能和活性等方面提供理论基础，也可以根据RDRP的活性中心结构丌展短肽小分子模拟的计算机辅助药物设计。关键词：家蚕质多角体病毒：RDRP基因；RT—PcR；表达；免疫电镜技术II型!巫皇窒重堕玺塑签堕墨堕堕塑苎圈塞堕：耋竺墨塞堡塑窒Cloning、expressionandlocationstudyoftheRNA—depen