实验三细胞冻存与复苏技术

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1、实验三细胞冻存与复苏技术谢云飞生科院医用生物学教研室3831928一、实验目的1．掌握细胞冻存与复苏的原理。2．熟悉体外培养细胞液氮冻存技术及冻存细胞的复苏技术。3．掌握细胞计数的一般方法。4.掌握离心机的使用方法二、实验原理在不加任何保护剂的条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变等，引起细胞死亡。向培养液中加入保护剂可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。目前细胞冻存多采用二甲基亚砜（DMSO）或甘油作保护剂，这两种物

2、质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，能提高细胞膜对水的通透性。复苏细胞采用快速融化的方法，使细胞迅速通过细胞最易受损的－50～0℃，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。细胞冻存及复苏的基本原则是“慢冻快融”。标准冷冻速度开始为-1到-2℃／min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入37-39℃热水中迅速解冻。三、实验步骤（一）冻存1．将1ml鸡血细胞悬液（1%）转移至离心管中，加入7ml生理盐水。2．1000rpm离心5min，弃上清液。3．向沉淀中加1ml冻存液，重悬。4

3、．将悬液转入冻存管中，将冻存管口封严。5．将冻存管装入吊桶，用两层纱布封口，悬吊于液氮罐口内的气态氮中放置20min，然后浸入液氮（-196℃）中。（二）复苏1.准备37℃的水浴箱。2.从液氮中取出吊桶，迅速将冻存管倒入37℃温水中并不断搅动，使冻存管中的冻存物在1min之内融化。3.将细胞悬液转移到离心管中，并加入5mL培养液。4.1000rpm离心5min，弃上清液。5.沉淀2ml培养液，吹打均匀。（三）染色和计数1.染色：用滴管吸取0.5ml细胞悬液放入干净试管中，再加0.4％台盼蓝染液0.5ml，用吸管轻轻吹打混匀，染色2min。时间不能延长，否则

4、活细胞也被染上色2.计数：用记数板计算细胞活力。（四）细胞活力测定实验操作1.熟悉计数板：计数板有前后两个计数室（见下图1），计数室与盖玻片的距离为0.1mm，每个计数室分九大格，各格边长为1mm，四角的大格被划分为16个中方格，用于白细胞计数及组织培养的细胞计数；中央的大格划分为25个中方格，每个中方格又被划分为16个小格，用于红细胞和血小板计数（见下图2）。用酒精棉球轻轻擦拭计数板的计数室面，晾干后盖上盖玻片于计数室上，用低倍镜观察计数板。图1.血细胞计数板平面图图2.计数室的分格 2.滴片：将擦干净的计数板放回实验台面上，用吸管吸取试管中已染色的细胞

5、悬液（注意吸前混匀），滴在计数板上盖玻片边缘，让细胞悬液自然流入计数室内（注意滴加的量不要过多或过少，计数室内不应有气泡存在），静置2min。3.计数：将计数板放到载物台上，在低倍镜下按一定方向（如顺时针）逐格数出计数室四角的每个大格内的活、死细胞个数。若细胞正好压在格线上，则按数上不数下、数左不数右的原则计数。活细胞：较大，椭圆形，透明，有核；死细胞：较小，圆形，蓝色。4.计算：①如计细胞总数则按下式求出细胞密度。四大格的细胞总数细胞密度（个/ml）＝─────────×10000×稀释倍数4注：1mL＝1000mm3，每大格的体积为0.1mm3，故式中

6、乘以10000便等于每毫升悬液中的细胞数。②如计算细胞活力则按下式求出细胞活力四大格的活细胞总数细胞活力＝─────────×100﹪四大格的细胞总数四、注意事项1．要做好冻存记录（如细胞名称、日期、罐中位置等）。2．操作时应戴手套，以免皮肤接触液氮而冻伤。3.使用血球计数板时光线不能太亮五、作业（1和2）与思考1.简述细胞冻存与复苏的原理2.每组同学复苏一管冻存细胞，计算细胞活力，如活力较低，试分析可能的原因。3.冻存细胞时有哪些注意事项？4.冻存细胞的复苏有哪些操作要领？5.试述台盼蓝染色法鉴别死活细胞的原理，并分析染色时间过长时本来是活细胞也被染上色

7、的原因。