斑马鱼△113p53基因功能研究

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1、⑧万方数据论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：答辩委员会主席：委员1：委员2：委员3：委员4：委员5：答辩日期：⑧万方数据Author’ssignature：Supervisor’ssignature：ExternalReviewers：ExaminingCommitteeChairperson：ExaminingCommitteeMembers：Dateofthesisdefence：万方数据浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注

2、和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或N其．。教。⋯．，=，。—’．。m--或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：罗牙．)签字日期：沙f垆年弓月歹日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解堑垄盘鲎有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权

3、书)学位论文作者签名：步豸、导师签名：签字日期：pf毕年毒月罗日签字日期：M叼年己月j日r万方数据浙江大学硕士学位论文摘要抑癌基因p53是一个转录因子，正常情况下并不活跃，可被多种逆境如：DNA损伤激活。p53激活后，可以主导大量基因表达和沉默，进一步抑制细胞周期进行DNA修复，损伤严重的细胞将走向凋亡，从而确保机体遗传物质的稳定性，防止变异的细胞在生长过程中发育成肿瘤。A113p53是一个N端缺失的p53异构体(人类中的orthologA133p53)，已有研究表n蝈A113p53是野生型p53的目标基因，由p53第4个内含子作为启动子来驱动表达的，在Y一射线照

4、射下大量表达；A113p53相对于p53并不是起着简单的显性抑制作用，而是通过改变p53下游基因的表达，特别是特异性提高抗凋亡蛋白Bcl2L的表达，从而阻止细胞凋亡。并且在很多癌细胞中过量表达。到目前为止所有有关△133p53／△i13p53功能的报道都是采用siRNA，morpholino或者mRNA进行的短暂研究，但还不知道它是否是一个致癌基因，以及在有机体生长、发育、繁殖、衰老等方面中的作用。本论文将通过构建可诱导表达A113p53转基因斑马鱼和特异性敲除A113p53斑马鱼突变体来深入探讨此基因在以上诸方面的作用。，T012转座子已被证明非常有效的提高斑马

5、鱼转基因频率，因此在此研宄中也将采用T012转座子体系来构建转基因鱼。本实验室曾经采用广泛表达的启动子来构建△113p53过表达转基因鱼，但经过大量工作后未能得到转基因鱼。可能原因是△113p53的过量表达会导致斑马鱼的死亡或影响其繁殖，所以本研究采用了带有RFP标签的四环素诱导的rtTA-CMVmini启动子来启动A113p53表达，从而构建了三个可诱导表达△113p53转基因斑马鱼系，为今后研究△113p53是否是致癌基因提供了必需的材料。万方数据浙江大学硕士学位论文摘要由于A113p53是一个N一末端缺失的p53蛋白异构体，所有的编码序列与全长p53重叠。因

6、此，为了不影响全长p53编码序列，我们选择敲除p53第4个内含子中△113p53启动子区域的必需元件以达到阻止A113p53mRNA表达。TALEN(transcriptionactivator—likeeffectornucleases)靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现己广泛应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等模式生物研究中。本研究采用TALEN基因敲除技术获得了A113p53启动子部分敲除的突变系。在己获得的A113p53突变体胚胎中，△113p53不能被y射线诱导表达，并且在照射后6天，照射的大部分野生型胚胎都成活，但这些突变体，全部死亡

7、。实验结果表明，通过部分敲除A113p53启动子，能够获得A113p53敲低的突变体：并且进一步证明A113p53在y一射线照射下起着保护机体的作用。关键词：A113p53，p53，TALENII万方数据塑兰奎兰堡主兰竺堡茎一堕堕塑耋．————————————————————————————————————————-———————————————————————————————————————————————————————————————二二二二—_二—二：．缩略词表(ListofAbbreviations)AAs，Aminoacids，氨基酸BCS，Bovin

8、ecalf