新型融合蛋白系统用于定量检测多种蛋白酶活性

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1、万方数据万方数据摘要蛋白酶在细胞和病毒中起重要作用，一些专一性蛋白酶用于去除用于大肠杆菌重组表达和亲和纯化的融合标签。研究不同蛋白酶的专一性和抑制剂对于疾病治疗以及开发工程用蛋白酶至关重要，大肠杆菌重组表达系统因生长速度快，易于操作和体系廉价成为研究体内和体外筛选蛋白酶突变体和抑制剂的首选。多种蛋白底物已用于指示不同蛋白酶的活性，但是存在范围窄和分析手段繁琐等缺点，为此本研究开发新型用于多种蛋白酶活性测定的融合蛋白底物系统，利用蛋白酶切除融合标签进而提高靶蛋白的酶活，通过耦联法测定蛋白酶活性，获得以下结果：1.分别构建了含七种不同的蛋白酶切割序列(人鼻病毒3C蛋白，烟草蚀斑病毒蛋白酶，X

2、a因子，SspDnaB内含肽，SceVMA1内含肽，凝血酶和肠激酶)的融合蛋白，其中融合蛋白上游含有不同的标签(His6，GST，纤维素结合结构域和MBP标签)下游分别含有和大肠杆菌和伤寒沙门氏菌2.3-二氨基丙氨脱氨酶(2.3-diaminopropionateammonia-lyase，DAL)。2.利用SDS-PAGE和蛋白印迹分别研究不同融合蛋白在大肠杆菌的表达，MBP融合表达在提高融合蛋白在大肠杆菌的表达最为有效。3.研究了一些不同蛋白酶抑制剂对大肠杆菌DAL(eDAL)活性的影响，结果表明它们对eDAL活性没有明显抑制作用。4.分析了表达上清的大肠杆菌DAL(eDAL)和伤寒

3、沙门氏菌DAL(sDAL)活性，结果表明不同标签对酶活性的抑制效果不同。5.分别分析了烟草蚀斑病毒蛋白酶和Xa因子裂解相应破碎上清液和纯化的融合蛋白底物活性，在相应的蛋白酶抑制剂作用下，蛋白酶活性明显降低。6.凝血酶对两种不同序列的融合蛋白切割效率不同，抑制剂不能去除这种裂解效率差异性。7.肠激酶能够切割eDAL，却不裂解sDAL，上清和纯化的融合蛋白可作为肠激酶底物，抑制剂降低肠激酶活性。8.仅有MBP标签对提高含有人鼻病毒3C蛋白酶作用序列的eDAL的表达水平比GST标签更有效，上清和纯化的MBP融合蛋白被人鼻病毒3C蛋白酶裂解，但活性受抑制剂影响。9.纯化的含有SspDnaB内含肽

4、融合蛋白可以用于检测不同温度下自降解效率。10.SUMO融合的eDAL可有效被构建的SUMO蛋白酶在胞内和胞外裂解，胞内蛋白酶活性与表达蛋白酶的水溶性成正相关。综上所述：本研究设计的基于DAL的融合蛋白系统可用于定量分析序列专一性I万方数据和构象依赖专一性的蛋白酶，并首次获得定量检测自我剪切的蛋白酶底物。和已报道的蛋白底物相比，本研究构建的蛋白酶底物可用于测定不同蛋白酶活性和专一性，而且分析方法快速简单。关键词：2.3-二氨基丙氨脱氨酶，蛋白底物，大肠杆菌，耦联分析，专一性蛋白酶II万方数据AbstractProteasesplaykeyrolesinmanyfundamentalcel

5、lularandviralprocesses.SomespecificproteasesarefrequentlyappliedforcleavingthefusiontagsusedinenhancingsolubleexpressionofrecombinantproteininEscherichiacoliandrapidpurificationbychromatography.Iiisveryimportanttostudytheproteasespecificityandthespecificinhibitorsforapplicationinbiotechnologyandf

6、ortherapytocurethediseases.Escherichiacoliexpressingsystemispreferentiallyselectedforscreeningtheengineeredproteasevariantsandspecificinhibitorsowingtofastgrowthofthehost,inexpensivecultureconditionsandeasymanipulation.Severalproteinsubstratesformonitoringanddetectingvariousproteaseshavebeenconst

7、ructed,buttheycanonlyappliedforsomespecificproteases,andsometime,thelaboriousanalyzingstepsareessential.Therefore,wedevelopedanewfusionproteinplatformforquantitativelymeasuringactivityofmultipleproteases.Theactivityoft