棕色棉纤维原花青素转运蛋白基因ghtt12的克隆与表达分析

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1、万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：—鲨时间：乙ol中年6月汐El关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保

2、存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：罢枸时间：2。rq-年6月吕El第一导师签名：南i塾。止3时间：∞f牛年6月圹日万方数据摘要㈣㈣㈣㈥㈣Y2753804棕色棉属于棉属陆地棉，是一种纤维本身就具有天然色彩的棉花，在后期加工过程中无需染料印染，能有效减少对环境的污染，降低生产成本。但棕色棉纤维颜色单一、着色不均匀、色牢度和色饱和度低等问题在很大程度上限制了其利用和发展。由于棉纤维属于种皮特化的细胞，而一般认为种皮的色素是由原花青素氧化

3、形成的，故推断原花青素可能是构成棕色棉纤维色素的一种成分。现有研究表明，TTl2是MATE家族的多药次生类转运蛋白，其功能是在原花青素代谢途径中将原花青素前体物质糖基化的表儿茶素通过反向运输的方式转运进液泡中，同时将H+排出液泡。因此研究棕色棉纤维刑2基因的功能，可以为利用基因工程技术对棕色棉色彩性状进行遗传改良提供了参考依据。本研究根据不同物种刚2同源基因的氨基酸序列的保守区域设计引物，结合RACE技术分离出GhTTl2基因的全长cDNA，并对其进行生物信息学分析。在棕色棉纤维发育的不同阶段研究其表达水平与原花青素积累的关系。构建原核表达

4、载体在大肠杆菌中对GhTTl2进行诱导表达。构建真核表达载体对GhTTl2进行亚细胞定位。主要结果如下：(1)通过同源基因克隆的方法从棕色棉纤维中获得了一+个聊2基因的全长cDNA，命名为Ghl7"12(Genbank登录号：KF240564)。该序列长1733bp，包含一个1503bpORF，编码500个氨基酸，推断编码蛋白的相对分子量为54kDa，等电点(PI)为6．99，分子式为C2507H3929N6150668821，具有典型的MATE家族保守结构域。(2)氨基酸序列比较结果显示GhTTl2与多个物种刚2基因编码的氨基酸序列具有较

5、高的同源性，说明聊2基因在进化过程中较为保守。系统进化树表明GhTTl2与可可TcTTl2具有最高的同源性，达到85．17％。(3)棕色棉纤维中可溶性原花青素和不可溶性原花青素的含量都是先上升后下降，且在花后l5d左右达到高峰期，而棕色棉纤维的原花青素含量在整个发育时期都远高于白色棉纤维。半定量RT-PCR及荧光定量RT-PCR表明GhTTl2基因在棕色棉纤维不同发育时期的表达量显著高于白色棉，最高达到6倍左右，且随着纤维的发育，G矗刚?基因的表达量逐渐降低。说明G矗聊2基因可能与稼色棉纤维色素的形成相关，且原花青素可能是棕色棉纤维色素的组

6、成成分。(4)成功构建了原核表达载体pET-32a(+)-GhTTl2，在大肠杆菌中采用不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同诱导温度条件下诱导GhTTl2基因的表达，但均未能获得理想的结果，可能是由于GhTTl2跨膜蛋白的疏水性结构过多，导致其在大肠杆菌中无法表达或表达过弱。成功构建了真核表达载体pCambial304．GhTTl2一GFP，激光共聚焦显微镜观察到GhTTl2是定位于液泡膜上。通过农杆万方数据菌介导的蘸花法转化pCambial304一GhTTl2．GFP重组质粒到拟南芥ttl2突变体中，使用抗生素筛选出1株抗性植株。关键词：

7、棕色棉，GhTTl2基因，原花青素，亚细胞定位，遗传转化H万方数据AbstractBrowncottonbelongstoGossypiumhirsutumL．withanaturallycolorfulfiber，SOitdosenotneedtoprintanddyeinpostprocessing，whichismorefriendliertoenvironmentandlowerproductioncostthanatraditionalwhitecotton．Neverthelesssuchproblemsasbeinglessc

8、olor,unevencoloring，lowcolorfastnessandlowcolorsaturationrestrictit’Sapplicationanddevelo