氧化石墨烯荧光淬灭

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1、1我报告的题目是基于碌酸化多肽降解受阻的石墨稀/多肽复合焚光探针用于蛋白激酶活性及抑制作用分析2蛋白激酶催化作用下的蛋白质憐酸化是生物体内翻译后修饰的重要方式之一。蛋白质的憐酸化和去磷酸化这一可逆过程几调节着细胞的发育、增殖、分化、信号转导、神经活动、肌肉收缩、细胞凋亡及肿瘤发生等过程在内的大部分生命活动。非正常的磷酸化会导致人体产生各种疾病,例如癌症或老年痴呆症等。因此,准确灵敏地检测过度磷酸化、分析蛋白激酶活性和高通量蹄选高效抑制剂对于人类一些重大疾病的早期诊断和治疗极为重要。传统用于蛋白激酶活性分析的方法依赖于放射性元素标记伽马-32P-A

2、TP法,由于放射性物质对环境及其人体的危害而随之被取代,基于憐酸特异性识别抗体的免疫技术[146]、突光分析方法表面等离子共振技术[184,185]以及质谱等都能有效用于蛋白激酶的活性分析。石墨稀(Graphene),是从石墨材料中剥离出来的由碳原子组成的二维晶体,是目前己知世界上强度最高的材料。石墨稀具有独特的电子、机械、热力学特性在化学、质量、压力等传感应用中独具优势,。与碳纳米管相似,石墨烯对有机荧光分子表现了有效的突光淬灭效果,这一过程中同时发生了激发态突光分子与石墨烯表面之间的能量转移和电子转移。2010年诺贝尔物理学奖氧化石墨烯薄片是

3、石墨粉末经化学氧化及剥离后的产物，氧化石墨烯是单一的原子层，仍然具有淬灭荧光的效果3本文首次提出了一种基于多肽/石墨烯突光浮灭机制和接肽酶降解作用的激酶活性分析方法。酪蛋白激酶CKII是一种重要的丝氨酸/苏氨酸选择性蛋白激酶,能磷酸化160种不同的蛋白质,我们以CKII为蛋白激酶模型。FITC标记的CKII底物多肽,FITC-peptide(FITC-RRRADDSDDDDD),能与GO发生有效的突光浮灭。幾肽酶CPY是一类肽链端解酶,作用于任何一个C-末端残基,从肽链的C端开始逐个降解,释放出游离氨基酸。FITC-peptide在CPY的消化作

4、用下释放出游离的FITC分子,在高离子强度环境下,游离FITC分子与GO之间的吸附较小而保持相当强的焚光。而当FITC-peptide在CKII/ATP催化发生磷酸化,有效地阻碍CPY在憐酸化丝氨酸位点的降解,使得FITC-多肽更容易与GO结合导致焚光淬灭。1羧肽酶CPY作用于任何一个C-末端残基逐个降解释放游离氨基酸，并释放出游离的FITC分子，在高离子强度环境下(猜想，故而加了氯化镁和钾)，与GO之间吸附较小保持相当强的荧光4.梭肽酶(carboxypeptidaseY,CPY)、Staurosporine、弗斯可林(Fskorlin)和3-

5、异丁基-1-甲基黄嘿呤(IBMX)购买于西格玛公司(中国上海)。cAMP-依赖型蛋白激酶(PKA,催化亚基)购买于Promega公司,酷蛋白激酶II(CKII)购买于NewEnglandBiolabs公司(美国)。突光素标记底物多肽:FITC-RRRADDSDDDDD(FITC-pep)、FITC-RRRADDpSDDDDD(FITC-Ppep)和FITC-LRRASLG(FITC-kemptide)ATP、蛋白酶抑制剂和改良型Bradford蛋白总浓度检测试剂盒牛血清蛋白(BSA)、三轻甲基氨基甲焼(Tris)、甘油、DTT、EDTASyner

6、gyMx酶标仪(BioTek仪器有限公司)进行突光光谱分析,所有样品用480nm作为激发波长,从500nm到700nm(25°C)扫描焚光发射谱图。5氧化石墨稀与多肽FITC-pep之间的劳光淬灭（氧化石墨烯对荧光强度的影响）FlTC-peptide+TBS+Tris-HCl+MgCb+KCl+氧化石墨稀在96孔酶标板中加入60nL浓度为的多肽(FlTC-peptide)溶液(溶于TBS,即20mMTris-HCl,10mMMgCb,50mMKCl,pH7.5),每孔中加入5pL氧化石墨稀(浓度40

7、igml/i),设定酶标仪混勻1min,在48

8、0nm激发下扫描500nm至700nm的突光发射光谱。考察氧化石墨烯的浓度因素时,加入石墨稀的浓度依次为0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mU'),酶标仪设定程序同上。考察FITC-peptide的多肽片段对氧化石墨稀的亲和力时,用游离的突光素FITC分子作为参照,与石墨稀在酶标板中混勻1min后进行劳光检测,程序同上。6氧化石墨稀(GO)与多肽之间通过亲疏水性、电子共辄、电荷吸附等发生相互作用。氧化石墨稀(GO)含有亲水性的离子化边缘和疏水性的中间片层因而具有两亲性,当突光染料标记的多肽与石墨烯共存时,由于亲疏水作

9、用、电荷吸附等作用而导致多肽结合在GO表面,荧光染料分子与GO发生较强的能量转移而导致焚光萍灭。当增加GO的浓度,FITC-peptid