苏云金芽胞杆菌芽胞期调控因子和cry蛋白表达关系的研究论文

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1、捅要摘要苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)，革兰氏阳性菌，芽胞杆菌属，其最明显的特征是在芽胞形成的同时会产生具有杀虫作用的晶体，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目等农林业害虫具有特异性杀虫活性，是目前国际上应用最广泛最成功的微生物杀虫剂。晶体主要由杀虫晶体蛋白组成，杀虫晶体蛋白由cry或缈基因编码。前人对不同类型的cry基因启动子的表达调控机制进行了较深入的研究，但对不同启动子的活性比较还未见报道。本研究比较了crylAc、c砂3Aa、cry4A和cry8Ea基因启动子在芽胞期母细胞调控因子spolIID突变体中的活性，并对芽胞形成相关基

2、因的sRNA进行了初步分析。通过13一半乳糖苷酶活性测定说明spolIID突变对crylAc和cry8E基因启动子转录活性没有显著影响，对c棚么启动子转录活性略有提高，而对cry4A基因启动子影响较大。H13．73菌株中PcrySE转录活性最高，PcG4A次之，然后是PcryIAc，Pcry3A转录活性最低。在HD-ASpolIID菌株中四个启动子的转录活性高低顺序与HD．73野生型菌株中·致，Pcry8E转录活性在liD．73菌株和spolIID突变株都是最高的。利用660rim蛋白定量试剂盒对上清液中总蛋白定量，取相同蛋白量上样，进行SDS-PAGE电泳。结果表明，在liD—ASpo

3、lIID菌株中，总蛋白量相同的条件下，PcrylAc、Pcry8E指导的CrylAc蛋白产量较高，Pcry4A次之，Pcry3A指导的CrylAe蛋白产量最低。对小菜蛾的室内生物活性，与不同启动子指导的蛋白产量的分析结果一致。为了分析crylAc野生拷贝对不同叫启动子指导crylAc基因表达的影响，在spolIID突变体基础上通过高温缺失了pHT73大质粒，获得了无晶体无芽胞突变体liD"．&SpolIID。在HD'-ASpolIID菌株中，总蛋白量相同的条件下，PcrylAc、Pcry8E指导的crylAc蛋白产量较高，Pcry4A次之，Pcry3A指导的PcrylAc蛋白产量最低，与

4、HD-SpolIID菌株中的蛋白表达情况一致。说明含有crylAc野生拷贝对于分析不同叫类型启动子强弱无显著的影响。通过上述分析筛选出了在HD．hSpolIID菌株中适合表达外源基因的高活性启动子crySE基因的启动子，为构建高效表达体系奠定了基础，同时也为新农药的开发提供了表达元件。对SM培养基中野生型菌株TO，T3，T7时期RNA混合样品进行30nt左右片段测序，对所得数据进行生物信息学分析，得到了15个芽胞形成与发育有关基因的候选sRNA。通过RT-PCR对候选sRNA转录活性以及上下游基因之间的关系分析初步确定了一个sRNA。关键词苏云金芽胞杆菌；spolIID基因突变株；c，y

5、基因启动子；转录活性；Cry蛋白表达量；sRNA东北农业大学理学硕士学位论文TheRelationshipofRegulatoryFactorsofSporesandCryProteinExpressioninBacillusthuringiensisAbstractThemostdistinctivefeaturesofthebacteriaBacillusthuringiensis(BOiSthattllevareGram-positive，Bacilliwhichproducescrystaltoxinsduringsporeformationandvegetativegrowth

6、．ThecrystaltoxinshavebeenfoundtobeactiveagainstagronomicalinsectspestsintheorderssuchasLepidoptera,Coleoptera，Diptera,Homoptera,Hymenoptera,Orthopteraandothernon-insectpests．Thecrystaliscomposedofinsecticidalcrystalproteinswhichisencodedbycryorcytgenes．Thoughtherehavebeenin-depthresearchonthemech

7、anismofregulationofexpressionofdifferenttypesofcrygene，theactivityofdifferentpromoterhasnotbeenreposed．ThisstudycomparestheactivitiesofthepromotersofcrylAc,cry3Aa,cry4A，crySEagenesinthemothercellregulatoryfactorsSpolII