牛环形泰勒虫表面抗原靶基因片段的筛选、鉴定及relisa诊断方法的建立和应用

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1、万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：营室两时间：劲I毕年6月B日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、

2、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)时间：纠乒年易月哆日时间：川年6月r)日歹P一昀蟊雨量侈疰j目／：．多名名签签生师究导研嬲6㈣978㈣02万方数据Y2本文是国家自然科学基金(新疆联合基金)一“新疆自然放牧区域蜱虫种群分布及其蜱传病地方流行关系的研究刀(项目编号：+U1170301)和自治区国际科技合作计划项目一“新疆蜱虫及蜱传原虫病防控技术的合作研究刀(项目编号：20126008)的部分研究成果课题主持人：

3、巴音查汗教授万方数据牛环形泰勒虫表面抗原靶基因片段的筛选、鉴定及rELISA诊断方法的建立和应用摘要牛环形泰勒虫病是由环形泰勒虫(Theileriaannulata)寄生于牛的红细胞、巨噬细胞和淋巴细胞内引起的以贫血、稽留热为主要临床症状的一种蜱传血液性原虫病。迄今为止，还没有防治环形泰勒虫病的特效药物，由于新疆特殊的地理环境条件，媒介蜱分布广而多，该病的发病率在我区呈逐年上升趋势，严重影响了养牛业的发展。因此，在牛环形泰勒虫病的防控工作中，在筛选病原表面抗原靶基因的基础上，研发高灵敏度及高通量的检测技术就显得尤为重要。本研究进行了如下三方面的研究工作：(i

4、)本研究，根据GenBank中已发表的牛环形泰勒虫Tamsl基因序列，设计合成5对引物，采用基因工程技术分别扩增Tamsl基因的全长基因(AE)、无N端及C端疏水区(BC)、仅缺乏N端疏水区(BE)片段，从而构建原核表达重组质粒。结果显示：成功地扩增了Tamsl基因的AE、BC、BE等片段，构建了pGEX．4T-2．BE，pGEX-4T-2-BC，pGEX．4T-2．AE、pET-28a-BC，pET-28a-BE，pET-30a-BC，pET-30a-BE等7种原核表达重组质粒；测序结果表明克隆的Tamsl序列及推导氨基酸序列与己发表的其它国家的虫株序列同

5、源性可达99％，但与我国甘肃株的同源性分别为92％和86％，本实验可为用精制抗原诊断环形泰勒虫病的研究奠定基础。(ii)本研究经基因工程方法，将重组质粒转化宿主菌BL21(DE3)后，采用IPTG诱导法表达融合蛋白，并采用SDS．PAGE电泳法分析比较各蛋白的表达形式和表达量，对含筛选的高效可溶性表达质粒的重组菌进行诱导条件优化，最终对纯化的蛋白进行Westemblotting检测。实验结果表明：成功表达出6种融合蛋白：SDS．PAGE检测筛选得出含pGEX-4T-2．BC(无疏水区靶基因)和pET-30a-BE(含C端疏水区靶基因)质粒的重组菌可分别高效表

6、达GST-BC(53ku)和His．BE(32ku)的可溶性蛋白；Westernblotting表明纯化的GST-BC和His．BE融合蛋白具有良好的反应原性，可作为诊断抗原。(iii)本实验，以纯化后的His．BE蛋白作为包被抗原，通过优化其反应条件后较成功地建立了检测牛环形泰勒虫抗体的间接ELISA方法；并进行了其敏感性、特异性、重复性等评测试验，应用建立的方法检测了样品(N=250)。结果显示：最佳抗原包被浓度为3gg／mL，包被时间为4。C过夜；最佳封闭液为3％脱脂乳；血清和酶标二抗的稀释度分别为l：100和l：12000，封闭时间、血清作用时间和酶

7、标抗体孵育时间都为lh；底物作用时间为20min；临界值为0．221。本试验所建立的间接ELISA方法具有一定的敏感、特异性，无交叉反应，其变异系数小于10％；应用建立的ELISA方法对吐鲁番地区的250份牛疑似血样进行了检测，结果显示环形泰勒虫感染率为39．2％，这结果被Westernblotting检测方法验证，符合率为96．7％。该参数可为我区牛环形泰勒虫病的防治奠定基础。关键词：环形泰勒虫；新疆虫株；；Tamsl基因：表面抗原靶基因筛选；间接ELISAI万方数据ScreeningandIdentificationofSurfaceAntigenTar

8、getGeneFragmentofTheileria