s1p2受体介导内皮细胞衰老的作用研究

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1、分类号VDC博士学位论文密级S1P2受体介导内皮细胞衰老的作用研究TheroleofS1P2receptorinsenescenceendothelialcells作者姓名：阊宏伟学科专业：内科学学院：湘雅三医院指导教师：袁洪教授论文答辩日期沙p．5，塔答辩委员会主席中南大学2012年05月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者

2、签名：』堑睦垒日期：21三年』月丑日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期：丝!：!年上月丑日博士学位论文中文摘要摘要目的通过分析体外培养的脐静脉内皮细胞衰老模型和来自老年大鼠的肺微血管内皮细胞中卜磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phosphate，SIP)受体的表达与细胞功

3、能改变的关联性，探讨S1P受体在内皮细胞衰老过程中的作用，试图阐明SIP受体途径促内皮细胞衰老的作用及为预防老年心血管疾病提供实验依据。方法1．在体外培养的人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)衰老过程中，分析S1P受体表达和内皮细胞功能的变化：分离人脐静脉内皮细胞，加入M199完全培养基进行培养，每3天传代一次。将细胞分组：内皮细胞培养至累积细胞群体倍增值(cumulativepopulationdoublinglevel，CPDL)约为15时，收集细胞，作为年轻细胞组(youngcells，Y)；CPDL约为35时，作为中年细

4、胞组(intermediatecells，I)；CPDL约为60时，作为衰老细胞组(senescentcells，S)。运用RT．PCR检测年轻、中年和衰老内皮细胞的S1P受体mRNA的表达；采用Westernblot检测年轻、中年和衰老内皮细胞的S1P受体蛋白的表达；应用Matrigel胶种植法评价年轻、中年和衰老内皮细胞体外管状样结构形成能力；利用细胞跨膜迁移实验分析年轻、中年和衰老内皮细胞的趋化能力。2．S1P2受体的shRNA腺病毒载体(shRNA．S1P2)构建及筛选：设计并合成4对靶向S1P2受体的单链寡核苷酸(SSoligo)，经变性、退火形成双链寡核苷酸(dsoligo)，并插

5、入穿梭质粒pRNAT．H1．1／Shuttle载体，测序验证后经脂质体介导转染人肺动脉内皮细胞(humanpulmonaryarteryendothelialcells，HPAEC)，通过RT．PCR方法筛选对S1P2受体基因沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT．H1．1／Shuttle．shRNA，然后提取质粒DNA，经双酶切，回收S1P2受体基因沉默效果最佳的shRNA片段，再亚克隆至腺病毒表达载体(pAdeno．X)，筛选出正确的重组子，转染到HEK293A细胞，收集重组的腺病毒，测定病毒滴度，通过Westernblot方法检测$1P2受体基因沉默的效果。3．调控S1P2受体的表达并分析其对

6、体外脐静脉内皮细胞功能的本研究得到国家自然科学基金(编号：30872709，81070277)和湖南省科技计划项目基金(编号：2010FJ3055)资助。I博士学位论文中文摘要影响：(1)过表达S1P2受体，观察体外脐静脉内皮细胞的功能变化：将培养的年轻脐静脉内皮细胞分别转染空质粒载体(pcDNA3．1)和重组质粒载体(pcDNA3．1／S1P2)；运用RT-PCR和Westernblot检测空白对照内皮细胞、转染空质粒pcDNA3．1和转染重组质粒pcDNA3．1／S1P2的内皮细胞S1P受体的表达；应用Matrigel胶种植法评价空白对照组、转染空质粒pcDNA3．1组和转染重组质粒pcD

7、NA3．1／S1P2组内皮细胞的体外管状样结构形成能力；采用细胞划痕实验检测空白对照组、转染空质粒pcDNA3．1组和转染重组质粒pcDNA3．1／S1P2组内皮细胞的损伤修复能力；利用细胞跨膜迁移实验分析空白对照组、转染空质粒pcDNA3．1组和转染重组质粒pcDNA3．1／S1P2组内皮细胞的趋化能力；(2)沉默S1P2受体的表达并检测体外衰老脐静脉内皮细胞的功能改变。将培养的衰老脐静脉内皮细