als转基因小鼠腰髓自噬改变及饥饿诱导自噬对突变蛋白表达的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文ALS转基因小鼠腰髓自噬改变及饥饿诱导自噬对突变蛋白表达的影响姓名：张坤西申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：郭艳苏；李春岩201203中文摘要ALS转基因小鼠腰髓自噬改变及饥饿诱导自噬对突变蛋白表达的影响摘要目的：肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一种神经系统变性疾病，其特征为选择性损害运动皮层、脑干及脊髓前角的运动神经元，表现为肌无力、肌肉萎缩、肌束震颤、腱反射亢进及病理征阳性，进行性加重，最终呼吸衰竭死亡。绝大部

2、分的ALS为散发性(90％～95％)，约5％～10％的ALS为家族性，约20％的家族性ALS与C“Zn超氧化物歧化酶(SODl)基因突变有关。目前该病发病机制尚不清楚，但随着病情进展突变SODl蛋白的聚集、泛素阳性包涵体的形成是ALS的两个重要病理特征。突变的SODl蛋白首先发生错误折叠、构象改变，暴露出蛋白内部的疏水残基，然后激活细胞内的蛋白酶体系统清除错误折叠蛋白，但是此途径只能对单体蛋白的降解起到作用，在一定程度上延缓了蛋白聚集物的形成。随着病程进展，受损蛋白的不断增多，当蛋白酶体系统不足

3、以完全清除这些蛋白的时候，蛋白酶体系统的成分如泛素也将参与聚集物的形成，并捕获受损的细胞器，形成难以降解的包涵体，细胞自噬可以降解具有聚集倾向的蛋白，因此细胞自噬溶酶体系统在SODl突变的ALS转基因小鼠中对突变蛋白降解起着极为重要的作用。自噬是一种生物长期进化保留下来的、受严格调节的、用于长寿命蛋白质以及细胞器等胞浆成分的降解与循环再利用的生物过程。自噬现象首先在酵母中被发现，后研究发现自噬普遍存在于真核细胞，通过溶酶体吞噬降解自身成分，是细胞内再循环的系统，也是一种重要的防御和应激调控机制，

4、细胞在受到外界条件的刺激(如饥饿)或者其内部条件发生变化(损伤的细胞器和胞质成分积聚)时都可以产生自噬。细胞可以通过自噬和溶酶体降解消化变性衰老的细胞、受损细胞器或变性蛋白质等使之免受细胞内毒物的损伤。自噬主要以细胞成分包括蛋白质和细胞器等在自噬体中分隔，并在溶酶体中降解为特征。总体来讲，自噬被认为是一种非选择性的降解机制。近来的研究表明自噬在很多生理和病理过程中扮演重要角色，比如对于神经退行性疾病突变蛋白和受损细胞器的清除等。自噬可以中文摘要以调控长寿蛋白和细胞器的降解利用，参与细胞质的重建、

5、维持细胞质的稳定，所以一般认为长半衰期的蛋白、有聚集倾向的蛋白由自噬途径来降解，无特异性，诱导性强。因此，自噬降解途径和ALS的发病可能存在密切关系。本实验应用家族性肌萎缩侧索硬化动物模型(SODlG93A转基因小鼠)，研究疾病不同时期自噬相关指标的改变，并以饥饿作为细胞自噬的诱导剂，观察饥饿诱导的自噬增强对ALS转基因小鼠病程不同阶段突变蛋白表达的影响。旨在研究调节自噬在ALS治疗中的可能作用。方法：l实验动物及分组采用SODlG93A转基因小鼠及其同窝非转基因对照小鼠，实验期间每天观察动物、

6、称重及评分。将SODlG93A转基因小鼠按症状分为症状前期(60天)、症状早期(100．120天)和终末期(130．150天)。60d同窝对照小鼠分别给予禁食Oh、6h、12h、24h、48h后取材。不同疾病时期饥饿组分别给予禁食48h。用10％水合氯醛按照350mg／Kg腹膜内注射麻醉，分别以4％多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取材。2免疫组织化学法4％多聚甲醛固定的脊髓腰膨大部位经振动切片机切成厚20I_un切片，0．01MPBS溶液漂洗；3％H202浸泡，封闭组织内源性过氧化物酶；O．3％tri

7、tonX．100穿孔；10％马血清室温封闭，分别加入抗p62和抗SODl抗体，二抗、辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素孵育后，DAB染色，捞片，脱水，透明及封片。OlympusBX51显微镜观察及照相。3共聚焦显微镜法4％多聚甲醛固定的脊髓腰膨大部位用20％蔗糖／4％多聚甲醛溶液浸泡过夜至组织沉底。冷冻环境下使用包埋剂OCT包埋组织，经冷冻切片机切成厚209rn切片，经漂洗、穿孔、封闭、一抗、荧光二抗孵育并再次PBS漂洗后，抗荧光衰减封片剂封片，OlympusFVl000激光共聚焦显微镜观察及照相。

8、4透射电镜法实验小鼠经4％多聚甲醛灌流固定后，准确定位腰髓前角并取材，继续固定于4％戊二醛中。0．1MPB漂洗，锇酸固定。丙酮梯度脱水，包埋中文摘要液浸透，包埋，超薄切片机切片。醋酸铀和柠檬酸铅染色后经JEM．1230透射电镜观察、照相。5蛋白免疫印迹实验小鼠经麻醉后，新鲜取材，取小鼠脊髓腰段，提取腰髓组织总蛋白，BCA法测蛋白浓度。蛋白上样，SDS．PAGE电泳后转膜，室温脱脂奶粉封闭后，分别加一抗4。C摇床过夜。次日，加入荧光二抗，洗膜，Odyssey红外扫描成像系统扫膜并分析结果。6荧光定