富勒烯(c60)对核酸分子的损伤效应研究

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1、华中农业大学硕士学位论文富勒烯（C60）对核酸分子的损伤效应研究姓名：林燕申请学位级别：硕士专业：土壤学指导教师：张捷；梁勇201206富勒烯(c曲对核酸分子的损伤效应研究摘要碳纳米材料的毒性效应日益受到广泛关注。在本研究中，利用不同实验方法和设计多种反应条件(温度，时间和离子强度等)，来检测富勒烯(C60)以及C60／Cu2+在避光条件下对质粒DNA构象的影响；并且以mRNA的reversetranscription-poly’merasechainreaction(RT-PCR)为体外实验模型，研究C60对RT反应

2、的影响，借以评估碳纳米材料的生物毒性，并阐明C60与生物大分子相互作用关系及其毒性作用的分子机制。C60对DNA构象影响的实验结果显示在非光催化条件下，C60可显著诱导DNA构象从超螺旋DNA转变成开环DNA或线性DNA，并且这种效应随C60浓度的增加，反应温度的升高以及时间的延长而增强；为了研究C60剪切DNA的作用机制，我们通过检测活性氧物质(reactiveoxygenspecies，ROS)捕获剂对C60剪切DNA作用的影响，来探讨这种剪切效应是否与ROS相关，实验结果显示单线态氧(102)的捕获剂均能有效消除

3、C60对DNA的剪切作用，同时我们利用商品化试剂盒检测反应体系中102的生成情况，实验结果显示二甲基4．亚硝基苯胺(MN-Dimethyl-p—nitrosoaniline，I矾O)吸光值随C60浓度的升高，温度的升高以及时间的延长显著下降；为了研究C60剪切DNA的作用是否具有位点特异性，我们利用不同限制性内切酶酶切C60处理后的线性DNA，实验结果显示线性DNA不能被多种限制性内切酶酶切成两个不同长度的DNA片段，另外，为了深入探讨C60剪切DNA的作用机制是否与水解相关，我们利用T4DNA连接酶连接C60处理后的

4、断裂DNA，发现断裂DNA不能被T4DNA连接酶连接成超螺旋DNA，但是我们发现有部分线性DNA被连接成开环DNA；最后，为了研究C60与DNA之间的相互作用关系，我们利用荧光定量PCR熔解曲线分析C60对PCR产物Tm值的影响，以及利用UV-Vis分光光度计检测C60对DNAUV-Vis吸收谱的影响，实验结果显示C60可显著降低DNA的Tm值，并且可促使DNAUV-Vis吸收谱发生红移现象。上述研究结果表明在非光催化条件下，C60可诱导DNA构象的改变，并且这种效应与C60浓度，反应温度和时间密切相关；并且C60可与

5、DNA相互作用，改变DNA构象稳定性；溶液中102的生成是C60诱导DNA断裂的主要原因，并且这种剪切作用没有位点特异性。为了探讨金属离子与C60复合效应对生物大分子的毒性效应，我们研究了多种金属离子和C60复合效应对DNA构象的影响，实验结果显示在非光催化条件下，C60／Mg：+，C60／Mn2+，C60／Ca2*和C6dZn2+对质粒DNA构象没有明显影响，c60／cC+可显著诱导DNA构象从超螺旋DNA转变成开环DNA，并且C60／Fe3+可诱导DNA完全降解。通过检测不同浓度Cu2+和C60复合效应对DNA构象

6、的影响，我们发现在非光催化条件下，C60／Cu2+对DNA的剪切效应随C60和Cu2+的浓度升高而增强。为华中农业大学2012届硕士研究生学位论文了进一步研究C6托u2+诱导DNA断裂的作用机制，我们利用T4DNA连接酶连接C60／CuE+反应后的断裂DNA，同时检测不同ROS捕获剂对C6托u2+剪切DNA作用的影响，实验结果显示断裂DNA被T4DNA连接酶连接成没有缺口的开环DNA，并且不同的ROS捕获剂均不能有效消除C60对DNA的剪切作用。上述研究结果表明在非光催化条件下，C6们u2+的复合效应可有效诱导DNA断

7、裂，并且这种效应与C60和Cu2+的浓度密切相关。C60对RT反应影响的实验结果显示C60均可显著抑制RT反应，并且这种效应与C60浓度密切相关；增加逆转录酶的酶量可以有效逆转C60对RT的抑制作用；RNA与C60在370C避光孵育12h后，C60可显著降解28SrRNA，并且具有浓度依赖性。上述研究结果表明C60不仅可抑制M-MLV逆转录酶活性，而且对RNA也具有一定的损伤作用。关键词：C60，RT，M．MLV逆转录酶，RNA，pBR322DNA，ROS，1022富勒烯(c酏)对核酸分子的损伤效应研究Abstract

8、Toxiceffectsofcarbonnanoparticleswere、析delyconcernednowadays．Inthisstudy,differentexperimentalmethodswereusedandvariousreactionconditionsweredesignedtostudytheeffecto