禽组织滴虫病流行病学调查及其分子生物学诊断方法的建立与应用

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1、禽组织滴虫病流行病学调查及其分子生物学诊断方法的建立与应用EpidemiologicalInvestigationandMolecularBiologicalDiagnosisofHistomoniasis硕士生：曲昌宝导师：许金俊副教授陶建平教授专业：预防兽医学资助项目：2013年江苏省基础研究计划(自然科学基金)面上项目“火鸡组织滴虫致弱株选育及其形成的分子基础研究，，(BK20131229)2014年江苏省普通高校专业学位研究生科研实践计划：“火鸡组织滴虫体外培养体系及人工感染模型的建立，，扬州大学2014年6月曲昌宝：禽组

2、织滴虫病的流行病学调查及其分子生物学诊断方法的建立与应用1禽组织滴虫病的流行病学调查及其分子生物学诊断方法的建立与应用中文摘要组织滴虫病又称黑头病或盲肠肝炎，是由火鸡组织滴虫(Histomonasmeleagridis)引起的鸡形目禽类的一种寄生虫病，以肝脏坏死、盲肠肿大和排硫磺样粪便为主要特征。出于公共卫生考虑，欧美地区己严格控制或者完全禁止使用防治该病的有效药物，导致该病频频发生流行，给养禽业造成了严重的危害。近年来，随着国内规模化生态圈养和放养等健康养殖技术的示范和推广，组织滴虫病流行和发生也越来越严重，而国内该病相关领域的

3、研究不多，因此，开展该病的研究对于养禽业的健康发展具有一定的意义。本研究首先开展了江苏及周边地区组织滴虫病的流行病学调查，对该地区火鸡组织滴虫分类地位和遗传进化进行了探索，在此基础上建立了敏感、特异和实用的分子生物学诊断方法，并对临床采集的样品进行了检测分析，主要研究内容如下：1．组织滴虫病的流行病学调查采用经典流行病学调查方法，对2012年1月一2013年12月两年的时间内江苏及周边地区经扬州大学动物医院畜禽群发病门诊部诊断为组织滴虫病的69个病例资料进行了详细的统计分析。统计分析结果表明：火鸡组织滴虫主要感染放养的禽类，31日

4、龄至60日龄最易感，成年禽类很少发病；该病的发病率相对较高，但60．87％的禽群死亡率低于10％：该病具有一定的季节性，在温暖、潮湿、多雨的夏初及秋季发生稍多，而早春、秋末及寒冷的冬季相对较少发生；主要症状为精神委顿，缩头垂翅，并排黄绿色稀粪，少数病例会出现血便，面部发绀的症状；剖检病理变化较为特征，确诊相对较易。调查结果为临床该病的控制和开展该病的进一步研究提供了一定的参考。2．火鸡组织滴虫18SrRNA基因的克隆及系统发育分析为从分子水平了解火鸡组织滴虫的分类地位和特征，以该地区自然感染火鸡组织滴虫肝组织为材料，通过DNA提取

5、、PCR扩增、DNA片段的克隆及测序，获得了30个火鸡组织滴虫18SrRNA序列。通过对这些序列和GenBank上收录的其他火鸡组织滴虫以及相关虫体18SrRNA基因序列进行系统发育分析后发现，该地区火鸡组织滴虫18SrRNA基因同源性在98．400／旷100％之间，亲缘关系很近，较为保守，可以用作分子诊断的靶基因。2扬卅I大学硕士学位论文同时，系统发育树也形成了五个不明显的分支，表明该地区火鸡组织滴虫有可能存在不同的基因型，有待进一步研究。3．火鸡组织滴虫ITS区基因的克隆及系统发育分析为进一步了解该地区火鸡组织滴虫是否存在不同

6、的基因型，对来自该地区的火鸡组织滴虫15个ITS基因序列及GenBank上收录的其他地区火鸡组织滴虫和相关虫体ITS区基因序列进行了系统发育分析。分析结果表明，该地区火鸡组织滴虫ITS区基因序列同源性在96．8．99．8％之间，亲缘关系仍相对较近，但形成了5个较明显的分支，存在不同的基因型。研究结果为进一步开展火鸡组织滴虫的分子流行病学调查以及种群遗传学研究奠定了基础。4．组织滴虫病PCR诊断方法的建立及应用以火鸡组织滴虫18SrRNA基因为靶基因，设计PCR引物，以确诊的感染火鸡组织滴虫的阳性鸡的肝组织DNA为模板，建立了组织滴

7、虫病的PCR诊断方法，并对临床样品进行检测。经过反应条件优化后的PCR方法阳性样品组织DNA的最低检出限为4ng／gL，其他常见鸡寄生虫的DNA样品中均未扩增出特异性条带。应用该PCR方法对收集的具有典型病变的组织滴虫病鸡肝脏样品进行了检测，检出率为100％，与组织病理学诊断结果符合率为100％。该诊断方法敏感、特异性，可用于组织滴虫病的临床诊断。5．组织滴虫病环介导等温核酸扩增诊断方法的建立与应用以确诊的感染火鸡组织滴虫的阳性鸡的肝组织DNA为模板，建立了针对火鸡组织滴虫的LAMP诊断方法并对临床样品进行检测分析。建立的LAMP

8、检测方法灵敏性高于传统的PCR检测方法，对火鸡组织滴虫的检出限为10个18SrRNA基因拷贝数；与其他临床上常见的鸡寄生虫无交叉反应。通过对临床疑似病例肝脏和盲肠样品检测以评估该检测方法，结果显示其检出率分别为100％并1]97．92％，高于传统的