胰蛋白酶及par-2对肝细胞癌增殖的影响及其机制研究

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1、河北医科大学硕士学位论文胰蛋白酶及PAR--2对肝细胞癌增殖的影响及其机制研究姓名：郑艳敏申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：谢立群201203中文摘要胰蛋白酶及PAR-2对肝细胞癌增殖的影响及其机制研究摘要目的：肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范围内常见高发的恶性肿瘤之一，死亡率高，预后差，手术或介入治疗后易复发，目前药物治疗效果不理想，严重危害人们的健康。肝细胞癌的发生发展与肿瘤细胞异常增殖和分化密切相关。因此，进一步研究肝细胞癌发生发展的分子机制，探求有效的治疗措施具有重要意义。蛋白酶激活受体。2(proteinase．activedrece

2、ptors2，PAR-2)是一种细胞膜表面受体，属于七次跨膜的G蛋白耦联受体超家族成员，广泛分布于哺乳动物体内多种组织和器官，可被胰蛋白酶、类胰蛋白酶、凝血因子Via和Xa等内源性激动剂激活，人工合成的小分子多肽SLIGKV-NH2也可模拟内源性激活剂的作用激活该受体。研究表明，在多种肿瘤组织及细胞中存在PAR-2的高表达，提示PAR-2可能与肿瘤的生物学特性和恶性程度密切相关。前期工作中，我们的研究发现肝癌组织中PAR-2的表达较癌旁组织明显升高，关于PAR-2对HCC细胞增殖的影响及其分子机制，目前尚不清楚。本试验通过体外培养人肝细胞癌细胞株HepG2，研究胰蛋白酶和SLIGKV-NH2

3、对肝癌细胞增殖的影响，并探讨其调节作用的可能分子机制。方法：采用免疫细胞化学染色法、免疫荧光法检测HepG2细胞PAR-2的表达与定位情况。分别利用胰蛋白酶、PAR-2激动肽SLIGKV-NH2、反PAR-2激动肽VKGILS-NH2、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、MEK(ERKl／2的上游)的特异性抑制剂PD98059干预细胞生长，细胞计数并绘制细胞生长曲线；MTT法检测对细胞增殖能力的影响；流式细胞术(FCM)检测细胞周期改变情况；Fura-2荧光法检测HepG2细胞[ca2qi变化；RT-PCR法检测PAR-2、吖m2、c-los、c．iun、c-myc、CyclinDl及PCNAm

4、RNA表达变化；Westemblot法检测PAR-2、ERKl／2、P．ERKl／2、c．fos、c-jun、c．myc、CyclinDl及PCNA蛋白表达变化。结果：PAR-2在肝细胞癌细胞HepG2中的表达与定位l免疫细胞化学法检测PAR．2的表达与定位：结果显示HepG2细胞与抗中文摘要PAR．2多克隆抗体具有较强的结合反应，PAR-2抗原表现为棕黄色，着色主要在胞膜和胞浆中。2免疫荧光化学法检测PAR-2的表达与定位：结果显示HepG2细胞经FITC染色后，在激光共聚焦显微镜下观察发现呈绿色荧光染色，着色主要在胞膜和胞浆中。PAR-2激动剂对肝细胞癌细胞HepG2增殖的影响1MTT法

5、检测不同浓度PAR-2激动剂对肝癌细胞增殖的影响：结果显示SLIGKV-NH2在1．50／unol／L、胰蛋白酶在1．25nmol／L时均能促进肝细胞癌细胞HepG2增殖，且呈浓度依赖性(尸<0．01或P<0．05)。SLIGKV-NH2在100gmol／L、胰蛋白酶在50nmol／L时，肝癌细胞增殖能力分别较SLIGKV-NH2在50lmaol／L、胰蛋白酶在25nmol／L时有所下降(尸<0．01)。而50lamol／LVKGILS-NI-12对细胞增殖能力的影响不明显，与对照组相比差异无显著意义(P>0．05)。2细胞计数并绘制生长曲线：通过生长曲线可以发现，在O一48h时间范围内，5

6、0Ijxnol／LSLIGKV-NH2、25nmol／L胰蛋白酶组的细胞数与对照组比较差异有显著意义(尸O．05)。PAR-2激动剂对肝癌HepG2细胞PAR-2mRNA及蛋白表达的影响lRT-PCR法检测PAR-2mRNA的表达：结果显示分别用25nmol／L胰蛋白酶、50grnol／LSLIGKV-NH2处理细胞后，PAR-2mRNA表达量分别为0．994-0．01，0．704-0．01(以[3-actin为参照的相对灰度)，对照组PAR-2mRNA表达量为

7、O．354-O．01，胰蛋白酶或SLIGKV-NH2组与对照组相比差异有统计学意义(P<0．01)。而50gmol／LVKGILS．NH2组PAR．2mRNA表达量为O．344-O．01，与对照组相比差异无统计学意义(P>0．05)。2Westernblot法检测PAR-2蛋白的表达：结果显示分别用25nmol／L胰蛋白酶、50Umol／LSLIGKV-NI-12处理细胞后，PAR．2蛋白表达量分别为3．02